Биоинженерная конструкция

Группа изобретений относится к медицине, в частности к материалам, используемым в качестве имплантируемых протезов костей, и представляет собой биоинженерную конструкцию на основе коралловой структуры типа Acropora cervicomes, предназначенную для замещения костных дефектов, и способ замещения костного дефекта с ее помощью. Биоинженерная конструкция, представляет собой фрагмент коралла, очищенный от коралловой пыли и микроорганизмов смоделированный в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта, и содержащий иммобилизованные на поверхности коралла аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки. Способ замещения костного дефекта, при котором имплантат изготавливают путем моделирования по результатам рентгенологического исследования в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта из предварительно очищенного цельного фрагмента коралла с последующей иммобилизацией на поверхности коралла аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, размещают готовый имплантат в дефекте и фиксируют его. Использование в клинической практике заявляемой биоинженерной конструкции и способа замещения костного дефекта с ее помощью предоставляет возможность замещения костных дефектов, имеющих размер критический или более критического, в том числе не закрывающихся самостоятельно, а также возможность замещения костных дефектов в костях различных видов - плоских и трубчатых в соответствии с естественными морфогенетическими потенциями.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к материалам, используемым в качестве имплантируемых протезов костей, и представляет собой биоинженерную конструкцию (далее - БИК) на основе коралловой структуры типа Acropora cervicomes, предназначенную для замещения костных дефектов (далее - КД), и способ замещения КД с ее помощью.

Материал скелета морских кораллов представляет собой уникальную пористую кальций-карбонатную структуру. Микроструктурное сходство скелетных материалов этих беспозвоночных с костью делает их потенциально применяемыми в качестве заместителя кости.

По объекту «Биоинженерная конструкция» известна Передняя перекрестная связка, сделанная с помощью биоинженерии (WO 00/69355). Известное изобретение представляет способ получения передней перекрестной связки ex vivo. Способ включает посев стволовых клеток в трехмерном матриксе, размещение засеянного матрикса путем прикрепления в двух местах, культивирование клеток внутри матрикса при условиях, предназначенных для роста клеток. При этом в качестве клеток-предшественников были использованы стромальные клетки костного мозга, а материалом для их фиксации в числе других был использован коралл Goniopora. В известной сложной биоинженерной композиции коралловый фрагмент выполняет ограниченную функцию материала для фиксации клеток, другими словами, носителя клеток, и не служит материалом для замещения КД.

Известен материал для костного протеза, включающий карбонат кальция, частично диспергированный в биорезорбирующем полимерном матриксе (US 5433751). Рассматриваемый материал содержит в качестве карбоната кальция измельченный скелет коралла. При использовании известного материала для костного протеза невозможно достичь указанных ниже лечебных результатов в силу того, что измельчение скелета коралла лишает его прочностных характеристик, что исключает возможность его использования для замещения крупных, в том числе критических, дефектов костной ткани в переходный период - до образования собственной зрелой костной ткани. Кроме того, измельчение скелета коралла снижает присущую ему пористость, необходимую для неоваскуляризации имплантата.

Весьма важное значение в процессе изготовления материала для замещения КД имеет методика подготовки природного коралла, в частности процесс очистки. Известен Способ очистки кораллов и кораллы, полученные этим способом (WO 2005/055885 Coral purification method and coral thus obtained), включающий экстракцию органических субстанций из кораллов, путем обработки кораллов жидкостью или смесью жидкостей при температуре меньше 270°С и давлении много большем, чем критическое давление жидкости или смеси жидкостей. В качестве экстрагентов авторы известного способа используют ацетон и/или этанол, которые сами по себе не являются биосовместимыми. Следствием этого является необходимость отмывки кораллов от ацетона и контроль за полнотой данной стадии.

Наиболее близкими к заявляемой БИК по совокупности признаков являются Продукты или структуры, сформированные для медицинских или аналогичных целей (WO 1999/002200 Shaped products or structures for medical or related purposes). Известные структуры сформированы из кораллов, в частности из кораллов относящихся к семейству Acropora (Acropora grandis), являются твердыми изделиями, могут быть использованы в качестве имплантатов, при этом в коралл адсорбирована терапевтически активная субстанция, в частности представляющая собой фактор, помогающий или содействующий росту кости.

Известные продукты или структуры, принятые в качестве прототипа, обладают рядом недостатков, препятствующих достижению указанных ниже лечебных результатов.

1. Процесс очистки природных кораллов состоит из промывки под гидростатическим давлением для уменьшения количества коралловой пыли и кратковременном размещении рабочего фрагмента коралла в жидком азоте. Однако в результате обработки жидким азотом в коралловой структуре могут произойти необратимые отрицательные изменения:

- возникновение трещин за счет разной скорости охлаждения поверхности и внутренних частей коралла;

- фиксация сохранившихся во внутренних частях коралла чужеродных органических структур.

- 2. В качестве активной субстанции, представляющей собой фактор, помогающий или содействующий росту кости используются в частности морфогенетические протеины, введение которых в организм может вызвать неконтролируемый рост костной ткани.

По объекту «Способ замещения костного дефекта» известна «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости», в соответствии с которым восстановление целостности кости осуществляют путем заполнения дефекта имплантатом, выполненным в форме аллогенного костного матрикса в виде соломки (хвороста) из деминерализованной кости, содержащего культивированные на нем клетки стромального и лимфомакрофагального ряда аутологичного костного мозга млекопитающих (п-т РФ 2240135). Однако в описании известного изобретения не содержится сведений о способе получения, структуре и иных физических свойствах костного матрикса, используемого в качестве основы для костного имплантата. Можно предположить, что указанный костный матрикс, выполненный в виде соломки (хвороста) изготовлен из аллогенной деминерализованной кости (трупный материал), то есть чужеродной субстанции органического состава. Следствием этого может быть перенос в организм реципиента инфекционных агентов, отторжение имплантата, аллергические реакции.

Наиболее близким к заявляемому способу замещения КД по совокупности признаков является «Продукт остеогенеза и процесс» (US 5563124), включающий имплантацию в тело продукта, содержащего карбонат кальция и фактор роста кости. При этом карбонат кальция используют в форме арагонита, полученного из натурального коралла. Факторы роста кости выбирают из группы, включающей: коллаген, фибрин, альгинат, или их смесь, а также смесь аминокислот, способствующих остеогенезу. Процесс замещения КД, включает:

- изготовление из куска коралла дисков, имеющих диаметр около 5-8 мм и толщину около 3 мм;

- пропитывание каждого кораллового диска раствором, содержащим один из выбранных факторов роста кости;

- изготовление имплантата замещаемого дефекта кости в соответствии с его размерами и формой;

- хирургическое размещение изготовленного имплантата в дефекте кости в форме единого блока.

Как следует из описания известного изобретения, продукт и процесс успешно опробован в эксперименте на крысах и кроликах. Авторы предполагают возможность использования продукта и процесса в операциях замещения бедра, колена, позвоночника, лечения остеопороза, возмещения опухолевых процессов, костных переломов.

Однако, известный способ, принятый в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, препятствующих достижению указанных ниже лечебных результатов.

1. Изготовление имплантата путем построения единого блока из нескольких отдельных коралловых дисков влечет за собой прерывистость во взаимосвязанной системе пор, следствием чего является неравномерность насыщения указанных пор терапевтически активной субстанцией, в частности раствором, содержащим один из выбранных факторов роста кости, и неравномерность в последующем процессе остеогенеза и резорбции коралловой составляющей имплантата. Кроме того, использование данной технологии построения единого блока из нескольких отдельных коралловых дисков возможно только для замещения незначительных по размерам дефектов кости, поскольку блок, составленный из дисков, не обладает требуемыми прочностными характеристиками.

2. Включение в состав имплантата чужеродного коллагена может вызвать реакцию отторжения.

3. Включение в состав имплантата сложных фармацевтических композиций, содержащих факторы роста кости может привести к неконтролируемому неоостеогенезу.

Заявляемая группа изобретений направлена на решение единой задачи создания БИК, предназначенной для эффективного замещения КД с образованием собственной зрелой костной ткани и разработки методики имплантации указанной конструкции в КД.

Использование в клинической практике заявляемой БИК и способа замещения КД с ее помощью позволяет достичь следующих технических (лечебных) результатов:

- возможность замещения КД, имеющих размер критический или более критического, в том числе не закрывающихся самостоятельно;

- возможность замещения КД в костях различных видов - плоских и трубчатых в соответствии с естественными морфогенетическими потенциями.

Указанные единые лечебные результаты при осуществлении группы изобретений по объекту БИК достигаются за счет того, что заявляемая конструкция, также как известная представляет собой имплантат для замещения КД, изготовленный из очищенного скелета коралла и содержащий терапевтически активную субстанцию.

Особенность заявляемой конструкции заключается в том, что в качестве коралловой составляющей используют фрагмент коралла, очищенный от коралловой пыли и микроорганизмов путем грубой механической обработки поверхности, промывки в холодной проточной воде, чередования циклов замачивания /высушивания с кипячением, и последующей стерилизации, смоделированный в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта, и содержащий в качестве терапевтически активной субстанции иммобилизованные на поверхности коралла аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (далее - ММСК).

Указанные единые лечебные результаты при осуществлении группы изобретений по объекту способ замещения КД достигаются за счет того, что также как в известном способе замещение КД, осуществляют путем изготовления имплантата на основе коралла, насыщения коралловой составляющей имплантата терапевтически активной субстанцией, хирургического размещения изготовленного имплантата в дефекте кости.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что имплантат изготавливают путем моделирования по результатам рентгенологического исследования в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта из предварительно очищенного цельного фрагмента коралла с последующей иммобилизацией на поверхности коралла аутологичных ММСК, размещают готовый имплантат в дефекте и фиксируют его.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Всем натуральным кораллам свойственна пористая кальций-карбонатная структура, однако различные виды кораллов отличаются в основном прочностью скелета и степенью его пористости. Эти параметры являются определяющими при выборе материала для замещения кости в переходный период до образования собственной зрелой костной ткани.

Для проведения описываемых ниже экспериментов авторами была выбрана коралловая структура типа Acropora cervicomes, которая обладает достаточной прочностью при оптимальной пористости и архитектонике поверхности, а именно плотность - 2,7 г/см³., пористость 10-12%, средний размер пор 500 (am. Меньшая пористость не позволяет клеткам достаточно быстро заселить коралловую структуру, что снижает скорость остеогенеза. Большая пористость значительно снижает прочностные характеристики имплантата, что не допустимо при замещении КД, имеющих размер критический или более критического.

Существенными признаками заявляемой БИК, непосредственно влияющими на лечебные результаты, являются разработанные авторами наиболее физиологичный способ очистки и подготовки исходного коралла, способ предкультивирования ММСК, а также моделирование имплантата в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта по результатам предварительного рентгенологического исследования.

Признаком заявляемого способ замещения КД, имеющим наибольшее влияние на лечебные результаты является размещение в дефекте готовой БИК. Как показали результаты эксперимента, при размещении в сформированном дефекте предварительно изготовленной БИК имеет место совпадение скоростей биорезорбции коралла и неоостеогенеза. При этом процесс образования костной ткани наблюдается по всему объему коралла одновременно.

Период времени от иммобилизации клеток на поверхности БИК до момента размещения готовой в дефекте составляет от 2 до 10 суток. При увеличении продолжительности указанного временного интервала в дальнейшем может возникнуть эффект избыточного образования костной ткани. Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе с помощью рентгенологического исследования определяют толщину кортикальных слоев, размеры костномозгового канала и предполагаемого сегментарного дефекта этой кости. Далее из цельного куска коралла Acropora cervicomes выпиливают имплантат, по своим форме и размеру соответствующий предполагаемому дефекту костной ткани, выявленным рентгенологическим методом. При изготовлении имплантата могут быть использованы инструменты, традиционно применяемые в травматологии и ортопедии.

На втором этапе сформированный коралловый имплантат (далее - КИ) подвергают очистке от коралловой пыли и мелких органических остатков. Очистку от коралловой пыли осуществляют путем грубой механической обработки поверхности с помощью щетки подходящего размера с жесткой синтетической щетиной под струей проточной воды. Далее КИ промывают в течение 3-4 часов в холодной проточной воде. Затем КИ замачивают в дистиллированной воде в соотношении (по объему) имплантат/Н₂О-1/10, при комнатной температуре в течение 8 часов, каждые 2 часа, перенося КИ в свежую порцию дистиллированной воды. Далее КИ высушивают в сухожаровом шкафу при температуре 50-60°С в течение 8 часов. Эти манипуляции с кораллом повторяют трижды. На последнем этапе КИ стерилизуют в стеклянном флаконе с соответствующей крышкой в стерилизационном пакете 2 часа при 160°С.

Для насыщения очищенного КИ ММСК осуществляют их выделение из образцов костного мозга, полученных во время операции или биопсии крыла подвздошной кости, культивирование и наращивание.

Для формирования БИК стерильный КИ, подготовленный как указано выше, переносят в культуральный флакон с вентилируемой крышкой, заполненный полной ростовой средой (ПРС) и выдерживают в течение 4 часов в СО ₂ -инкубаторе (37°С, 5% CO₂). ММСК 2-4 пассажей (160-400 тыс.кл./см²) помещают в посуду для роллерной установки подходящего объема с герметичной крышкой и переносят в эту посуду КИ из ПРС. Далее посуду с ММСК и КИ помещают в СО₂ - инкубатор (37°С, 5% СО₂ ) на роллерную установку на 18-20 часов (скорость вращения - 4 об/мин), что обеспечивает равномерное прикрепление ММСК к КИ.

Далее за 2-10 дней до планируемого оперативного вмешательства БИК культивируют в ПРС в стационарных условиях в CO₂ - инкубаторе (37°С, 5% СО₂) каждые 2-3 дня производя замену ПРС. На протяжении культивирования производят микроскопический контроль БИК (инвертированный микроскоп) и контроль ее стерильности по стандартным методикам.

На Фиг.1А представлен общий вид БИК (КИ с иммобилизованными на нем ММСК после 3-х недель культивирования). Фиг.1Б представляет собой фото фрагмента нативного коралла, Фиг.1В, Г, и Д - фото того же фрагмента коралла, заселенного ММСК in vitro с различной степенью увеличения (окраска клеток гематоксилин-эозином или 2-,4-,5-дифенилтетразолитбромистым). Результаты контрольных исследований показывают, что культивированные стволовые клетки заселили всю толщу объема коралла по порам и их количество увеличилось в несколько раз.

Оперативное вмешательство, направленное на замещение КД с помощью БИК, изготовленной на основе КИ и ММСК, осуществляют по правилам, принятым в травматологии и ортопедии при использовании имплантатов.

БИК в культуральной посуде доставляют в операционную из лаборатории непосредственно к этапу ее размещения в дефекте. Транспортировку осуществляют в герметичном термостатируемом контейнере. Промежуток времени между извлечением емкости с БИК из С02 - инкубатора и ее имплантации не должен превышать 3 часов.

В процессе операции на этапе размещения БИК в дефекте кости ее извлекают пинцетом/зажимом из культуральной посуды и имплантируют в дефект.

Все последующие этапы операции осуществляют по принятым в клинике стандартам.

В модельном эксперименте по замещению дефекта бедренной кости барана на первом этапе был сформирован циркулярный дефект бедренной кости и сделан рентгеновский снимок бедра с дефектом. Далее из цельного куска коралла Асгорога cervicomes был выпилен имплантат, по своим форме и размеру соответствующий образованному дефекту костной ткани, выявленному рентгенологическим методом. Сформированный имплантат соответствовал толщине кортикальных слоев, размерам костномозгового канала и предполагаемого сегментарного дефекта этой кости. При изготовлении имплантата были использованы инструменты, традиционно применяемые в травматологии и ортопедии.

В соответствии с описанной выше методикой сформированный КИ был очищен от коралловой пыли и мелких органических остатков, была изготовлена и размещена в дефекте БИК. Рентгеновский снимок размещения БИК в дефекте кости представлен на Фиг.2, на котором показана интактная конечность (А) и конечность с БИК, размещенной в дефекте через сутки после операции (Б). На Фиг.3 представлена схема размещения и укрепления БИК в дефекте бедренной кости барана. Каждый месяц после оперативного вмешательства животному осуществляли рентгенологическое исследование оперированной конечности.

Через 4 месяца животное вывели из эксперимента. Из тканей в области оперативного вмешательства были изготовлены парафиновые блоки и срезы. Путем микроскопии препаратов установлена полная резорбция вещества коралла и его замещение правильно организованной костной тканью разной степенью зрелости с формированием остеонов, костных балок, очагов костно-мозгового кроветворения. На Фиг.4 представлены фотографии, иллюстрирующие процесс остеогенеза на месте имплантата, размещенного в дефекте бедренной кости барана по истечении четырех месяцев после операции:

- Фиг.4а - участок незрелой костной ткани;

- Фиг.4в - формирующийся остеон;

- Фиг.4с - формирующиеся костно-мозговые лакуны.

На Фиг 5 представлено фото макропрепарата задней конечности барана в области КД через 4 месяца после имплантации БИК. Фиг.5 А - вид костной мозоли на месте дефекта. Фиг.5 Б - костная ткань в распиле на месте дефекта, замещенного БИК.

Таким образом, заявляемая группа изобретений обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.

1. Биоинженерная конструкция, представляющая собой имплантат для замещения костного дефекта, изготовленная из очищенного скелета коралла и содержащая терапевтически активную субстанцию, отличающаяся тем, что в качестве коралловой составляющей используют фрагмент коралла, очищенный от коралловой пыли и микроорганизмов путем грубой механической обработки поверхности, промывки в холодной проточной воде, чередования циклов замачивания/высушивания с кипячением, и последующей стерилизации, смоделированный в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта, и содержащий в качестве терапевтически активной субстанции иммобилизованные на поверхности коралла аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки.

2. Биоинженерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве коралловой составляющей выбрана структура типа Acropora cervicornes.