Биочип для диагностики в области медицины

Биочип относится к диагностическим устройствам и может использоваться для дифференциальной диагностики онкологических новообразований молочных желез. Биочип состоит из пластиковой подложки, разделенной на две части - рабочую и для фиксации биочипа в руках. Рабочая часть биочипа разделена на 15 равных ячеек (3 ряда по 5 ячеек в каждом) посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержат флуоресцентные антитела (0,01 мкл). В первом ряду (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам Эстрогена, во втором ряду (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам Прогестерона, в последнем (третьем) ряду (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам HER-2neu. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавляют реагент PBS в количестве 0,1 мкл, а сверху рабочей поверхности нанесена гидрофобную пленку, для предотвращения высыхания флуоресцентных антител и перемещения антител из одной ячейки в другую. Биочип обеспечивает возможность диагностики опухолевой ткани, взятой из разных участков опухоли, что расширяет арсенал средств и устройств, используемых для диагностических целей. Удобен в работе, не требует больших временных затрат.

Полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике и может быть использована для диагностики рака молочной железы, а именно солидных опухолей, имеющих большую молекулярную массу. Предлагаемая полезная модель может использоваться в иммунологии и цитологии, а также в ветеринарии.

Современная медицина базируется на точной диагностике и точном лечении, основанном на корректирующем воздействии на отдельные органы и системы организма.

Поэтому во всем мире активно развиваются методы скрининга - одновременный анализ состояния пациента по нескольким сотням или даже тысячам параметров - и, на основе связей между ними, воссоздание точного состояния организма с вынесением правильного диагноза. Создание биочипов является одним из наиболее революционных технологических достижений биотехнологии последних лет.

Известен биочип (RU 2436843, МПК C12Q 1/00; публ. 27.12.2008 г.) состоящий из твердого носителя, рабочих зон с кластерами, содержащими зонды и идентификатор. Твердый носитель, в свою очередь, состоит из двух частей, связанных между собой посредством гибкого многослойного листа, закрепленного на их поверхности с помощью клеевого слоя. Кластеры с зондами расположены симметрично относительно продольной или поперечной оси носителя на многослойном гибком листе и/или на поверхности твердого носителя. При сгибе многослойный лист обеспечивает совмещение кластеров с зондами, расположенных на первой и второй частях носителя, и формирование реакционных объемов либо с помощью сквозных отверстий, выполненных в гибком многослойном листе, расположение которых совпадает с расположением кластеров, или с помощью прокладок, закрепленных по краям многослойного листа и снабженных клеевым слоем.

Недостатком известной полезной модели является невозможность визуализации результатов реакции в проходящем свете, так же модель не применима для исследования цельных клеток, так как содержит праймеры для фрагментов нуклеиновых кислот.

Известен микрочип (патент RU (11) 2363955, МПК G01N 33/543, дата публ. 20.11.2008 г.) для множественного параллельного количественного иммунологического анализа соединений. Микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов заданного объема, сформированных на подложке методом фото- или химически индуцируемой полимеризации и содержащих одинаковые или различные по своей природе биологические молекулы (лиганды). Способ проведения количественного иммуноанализа предусматривает инкубацию микрочипа в реакционной среде, включающей анализируемый образец, для образования комплексов.

Хотя авторы известного изобретения указывают на возможность его использования во всех отраслях медицины и возможность проведения диагностики по патологически измененной биоткани, однако в диагностике рака молочной железы известный биочип не нашел применения в связи с недостаточной точностью диагностики.

В качестве прототипа выбран известный биочип, содержащий прозрачную подложку, на которой размещены фоновые участки подложки, не содержащих иммобилизованных антител и тестовые участки с иммобилизованными антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток (РФ патент на полезную модель 86091 от 27.08.2009 г., МПК A61B 10/00 «Биочип» авт. Шишкин А.В.).

Известный биочип работает следующим образом.

На биочип пипеткой наливают жидкость, которая не выливается за пределы рабочей области, благодаря бортику. При необходимости закрывают крышкой предотвращающей испарение или разбрызгивание жидкости. Осуществляют инкубацию биочипа с данной жидкостью, после чего жидкость сливают. В процессе анализа последовательно используются различные жидкости. Последовательность выполнения манипуляций может быть следующей: обработка блокирующим раствором, отмывка детергентом, инкубация с исследуемым образцом клеточной суспензии, отмывка буферным раствором для устранения не связавшихся с антителами клеток, обработка фиксирующим веществом, обработка раствором красителя, ополаскивание водой. Затем снимают или отламывают бортик и проводят микроскопическое исследование биочипа. Осуществляют считывание и анализ результата.

Недостатками известной полезной модели являются:

Пределы рабочей области снабжены бортиками, которые предотвращают выливание исследуемой жидкости за пределы рабочей области, вместе с тем возможна блокировка фоновых участков, так как они между собой не разделены и возможно смешивание исследуемых суспензий клеток. Известное устройство содержит крышку, которая предотвращает испарение и разбрызгивание исследуемого материала, однако крепление к бортику ее не надежно и возможна ее потеря, смешение исследуемого материала и искажение результатов, что влияет на точность и объективность диагностики.

Задачей предлагаемой полезной модели является повышение точности диагностики, путем предотвращение смешения исследуемых суспензий клеток, обеспечение предотвращения испарения и разбрызгивания исследуемого материала.

Поставленная задача решается тем, что в известном биочипе, содержащем прозрачную подложку, выполненную из полилизина, на которой размещены тестовые участки (пятна биочипа) с иммобилизованными антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток, другая часть подложки не имеет специфического покрытия, не менее 15 тестовых участков снабжены флуоресцентными антителами по 0,01 мкл и реагента PBS по 0,1 мкл в ячейках к рецепторам эстрогена, прогестерона и HER-2neu, тестовые участки закрыты сверху гидрофобной пленкой, выполненной из поликсилоксана.

Полезная модель поясняется изображениями (фиг.1, 2).

На фиг.1 изображен предлагаемый биочип, общий вид; на фиг.2 - внешний вид биочипа.

Предлагаемое устройство (фиг.1) содержит прозрачную подложку 1, разделенную на две части: одна из которых 2 имеет полилизиновое покрытие и является рабочей поверхностью устройства, другая часть подложки 3 не имеет специфического покрытия и предназначена для фиксации биочипа в руках. Рабочая поверхность биочипа 2 разделена на 15 равных ячеек (3 ряда по 5 ячеек в каждом) посредством решетки из пластика 4. Каждая ячейка содержит по 0,01 мкл флуоресцентного антитела. В каждой ячейке содержат флуоресцентные антитела(0,01 мкл). В первом ряду 5 (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам Эстрогена, во втором ряду 6 (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам Прогестерона, в последнем (третьем) ряду 7 (5 ячеек) содержат флуоресцентные антитела к Рецепторам HER-2neu. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавляют реагент PBS в количестве 0,1 мкл, сверху рабочей поверхности наносят гидрофобную пленку 6, для предотвращения высыхания флуоресцентных антител и перемещения антител из одной ячейки в другую. Биочип хранят в темном месте для исключения выцветания метки.

Пластиковая подложка имеет размеры 25,4 мм×76,2 мм, толщину 1 мм. Рабочая поверхность имеет размер 25,4 мм×55 мм, а поверхность для фиксации биочипа в руках 21,2 мм×25,4 мм. Решетка из пластика изготавливают толщиной 2 мм.

Предлагаемая полезная модель отвечает критерию «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников информации, которые бы порочили новизну предлагаемой полезной модели. Предлагаемое устройство отвечает критерию «промышленная применимость», так как может использоваться в онкологии для диагностики рака молочной железы.

Предлагаемый биочип позволяет получить следующий технический результат.

Предлагаемый биочип обеспечивает возможность диагностики опухолевой ткани, взятой из разных участков опухоли, что расширяет арсенал средств и устройств, используемых для диагностических целей.

В предлагаемом биочипе тестовые участки разделены решеткой, благодаря этому исследуемые суспензии клеток не смешиваются. Для предотвращения и разбрызгивания исследуемого материала предлагаемый биочип покрыт сверху гидрофобной пленкой из поликсилоксана. Биочип позволяет повысить точность диагностики, так как тестовые участки разделены решеткой, благодаря этому исследуемые суспензии клеток не смешиваются. Для предотвращения и разбрызгивания исследуемого материала биочип покрыт сверху гидрофобной пленкой из поликсилоксана, что также способствует объективизации исследований.

Устройство удобно в работе, не требует больших временных затрат.

Предлагаемый биочип работает следующим образом.

Опухолевый узел рассекают на несколько частей в любом месте. Щетками для взятия цитологических мазков берут соскобы с обнаженной поверхности опухоли из пяти мест, причем для каждого забора материала используют новую щетку. Затем щетку помещают в пробирку с раствором PBS количеством 0,1 мкл, центрифугируют и осажденные клетки микропипеткой наносят в три ячейки с различными антителами: эстроген, прогестерон и HER-2neu. Эту манипуляцию повторяют для каждого исследуемого участка опухоли. На пластиковую подложку помещают материал для исследования. Перед внесением осажденных клеток в тестовые участки биочипа, устройство, которое содержит тестовые участки с нанесенными на них антителами эстрогена, прогестерона, HER-2neu, готовят к работе. Для этого с рабочей поверхности биочипа удаляют защитную гидрофобную пленку, после чего незамедлительно производят перенос клеток на тестовые участки биочипа. Затем, биочип ставят на водяную баню, и закрывают непрозрачной крышкой, для исключения попадания света, на 30 минут. После водяной бани биочип помещают на предметное стекло флуоресцентного микроскопа и проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек по следующим параметрам: количество флуоресцентно окрашенных клеток, яркость флуоресценции, характер расположения метки (ядро, цитоплазма, мембрана). После проведения исследования каждой из областей под флуоресцентным микроскопом с рабочей поверхности удаляют излишки PBS и производят фиксацию клеток этанолом. После чего производят краску по Романовскому-Гимзе и проводят морфологическое исследование клеток. Проводят подсчет клеток в каждой из ячеек и сравнивают данные с количеством флуоресцентных меток полученных при анализе на флуоресцентном микроскопе.

Пример использования предлагаемого микрочипа дан в виде

Больная К. проходила лечение по поводу рака правой молочной железы T2N1Mo. На первом этапе выполнена операция радикальная мастэктомия по Маддену справа. Операционный материал представлен молочной железой размерами 100×80×60 мм, на границе правого верхнего и нижнего наружных квадрантов опухолевый узел 20×15 мм. В аксилярной клетчатке три лимфатических узла размерами 5×10 мм наибольший. На пластиковую подложку помещали материал для исследования. Перед внесением осажденных клеток в ячейки биочипа, устройство готовили к работе. Для этого с рабочей поверхности биочипа удаляли защитную гидрофобную пленку, после чего незамедлительно производили перенос клеток в ячейки биочипа. Затем, биочип ставили на нагревательный столик с помещенной на его поверхность влажной бумажкой, и закрывали непрозрачной крышкой, для исключения попадания света, на 30 минут. После водяной бани биочип помещали на предметное стекло флуоресцентного микроскопа. В первой линии: в ячейке эстрогена 4 светящиеся метки, в ячейке Прогестерона 3 светящиеся метки, а в ячейке Her2neu 0 светящихся меток. Во второй линии: в ячейке эстрогена 5 светящихся меток, в ячейке Прогестерона 2 светящиеся метки, в ячейке Her2neu 0 светящихся меток. В третьей линии в ячейке эстрогена 6 светящихся меток, в ячейке Прогестерона 2 светящихся метки, а в ячейке Her2neu 0 светящихся меток. В четвертой линии в ячейке эстрогена 3 светящихся метки, в ячейке Прогестерона 3 светящихся метки, а в ячейке Her2neu 0 светящихся меток. На пятой линии в ячейке эстрогена 4 светящиеся метки, в ячейке Прогестерона 3 светящиеся метки, а в ячейке Her2neu 0 светящихся меток. После подсчета флюрисцирующих меток путем стряхивания удалили излишки буферного раствора и в ячейки добавили по 0,3 мл этанола для фиксации. Затем в каждую ячейку добавили по 0,4 мл окрашивающего раствора Романовского-Гимзы на 45 минут. После этого удалив излишки краски провели морфологическое исследование. В результате удалось установить, что во всех ячейках находятся клетки карциномы молочной железы. При подсчете клеток в ячейках удалось установить, что в первой линии в ячейке эстрогена 10 клеток, в ячейке Прогестерона 8 клеток, в ячейке Her2neu 9 клеток. На второй линии в ячейке эстрогена 8 клеток, в ячейке Прогестерона 11 клеток, а в ячейке Her2neu 9 клеток. На третьей линии в ячейке эстрогена 12 клеток, в ячейке Прогестерона 8 клеток, а в ячейке Her2neu 10 клеток. В четвертой линии в ячейке эстрогена 9 клеток, в ячейке Прогестерона 13 клеток, а в ячейке Her2neu 12 клеток. На пятой линии в ячейке эстрогена 7 клеток, в ячейке Прогестерона 6 клеток, а в ячейка Her2neu 7 клеток. Было установлено, что 47,8% исследуемых клеток опухоли имеют рецепторы к Эстрогену, 28,2% клеток имеют рецепторы к Прогестерону и 0% клеток экспрессируют Her2Neu. Во время проведения рутинного иммуногистохимического исследования выявлено, что клетки опухоли экспрессируют рецепторы к эстрогену, Прогестерону и не экспрессируют рецепторы к HER2neu.

Биочип, содержащий прозрачную подложку, выполненную из полилизина, на которой размещены тестовые участки подложки с иммобилизованными антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток, и другую часть подложки, не имеющую специфического покрытия, отличающийся тем, что тестовые участки количеством 15 снабжены флуоресцентными антителами по 0,01 мкл и реагента PBS по 0,1 мкл в ячейках к рецепторам эстрогена, прогестерона и HER-2neu, закрытые сверху гидрофобной пленкой, выполненной из полисилоксана.