Липосомальное противовирусное средство на основе интерферона альфа-2b человека в капсулированной форме

 

Полезная модель относится к сухим лечебно-профилактическим формам интерферона альфа-2b человека в виде липосомальных частиц, размещенных в капсулах с наполнителем, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине. Техническим результатом предлагаемого изобретения является улучшение потребительских свойств липосомальной лекарственной формы в капсулах, при котором активность альфа-интерферона сохраняется на высоком уровне до 36 месяцев. Липосомальное противовирусное средство на основе интерферона альфа-2b человека в капсулированной форме, характеризуется тем, что каждая капсула выполнена в виде полой оболочки с наружным пленочным покрытием, в которой размещены порошкообразный наполнитель и распределенные в наполнителе липосомы, причем, наполнитель состоит из лактозы, натрия хлорида, натрия фосфата двузамещенного 12-водного и натрия фосфата однозамещенного 2-водного, а каждая из липосом выполнена из полой оболочки, содержащей лецитин или фосфатидилхолин, холестерин и альфа-токоферол и расположенного внутри оболочки ядра, включающего рекомбинантный интерферон альфа - 2b человека, при следующем содержании всех компонентов капсулы (мг): наполнитель: лактоза 146,94-168,18; натрия хлорид 13,64-14,00; натрия фосфат двузамещенный 12-водный 7,6-8,0; натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,94-1,0; оболочки липосом: лецитин или фосфатидилхолин 60,38-81,68; холестерин 6,64-8,98; альфа-токоферол 0,82-1,12; ядра липосом: рекомбинантный интерферон-альфа, ME - (2,5-10)105. Оболочка каждой капсулы выполнена из желатина, а наружное пленочное покрытие каждой капсулы выполнено из пищевого и фармацевтического полимерного материала. 2 з.п.ф, 1 табл. и 2 ил.

Полезная модель относится к сухим лечебно-профилактическим формам интерферона альфа-2b человека в виде липосомальных частиц, размещенных в капсулах с наполнителем, и может быть использована в фармацевтической промышленности и медицине.

В клинической практике для лечения вирусных инфекций, в частности гепатита В, широко применяется рекомбинантный альфа-2b-интерферон человека - один из известных субтипов лейкоцитарного интерферона.

Известно, что включение рекомбинантного альфа-интерферона в липосомы усиливает его антипролиферативную активность в эксперименте на опухолевых клетках (Eppstein D.A., Stewart W.E. Altered Pharmacological Properties of Liposome-Associated Human Interferon-Alpha. J. Virology, 1982, vol. 41, N 2, p.575-582). Причем, различные способы ассоциации с мембраной липосом в зависимости от состава липидов приводят к измененной фармакокинетике интерфероновых препаратов в эксперименте на мышах (Killion J.J., Fan D., Bucana C.D., Frangos D.N., Price J.E., Fidler I.J. Augmentation of Antiproliferative Activity of Interferon Alfa Against Human Bladder Tumor Cell Lines by Encapsulation of Interferon Alta Within Liposomes. J. of the Nat. Cancer Inst, 1989, vol.81, N 18 p.1387-1392).

Известен противовирусный препарат местного действия для внутрикожного введения на основе интерферона-альфа, включенного в липосомы (международная заявка, WO 91/01719, МПК А61К 9/127, опубл. 1991).. Препарат исследован на экспериментальной модели инфекции герпеса у морских свинок. Липосомы получены из липидов характерных для рогового слоя кожи.

Известна липосомальная лекарственная форма для перорального применения, содержащая человеческий альфа-интерферон (патент США 5503828, МПК А61К 38/00, опубл. 02.04.1996 г.). Однако конкретный состав лекарственной формы не указан.

Известен другой противовирусный препарат на основе рекомбинантного бета-интерферона, включенного в липосомы, предназначенный для местного или парентерального (подкожного, внутримышечного) применения (Европейский патент 172007, МПК А61К 9/127, опубл. 1986). Для парентерального применения противовирусный препарат в липосомальной форме содержит:

Рекомбинантный бета-интерферон, ME-2×108

Человеческий сывороточный альбумин, г - 1,25

Декстроза, г - 1,25

Смесь диарахидоилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилглицерина (7:3), ммоль - 2,0

Солевой раствор (0,9%), мл - 100

Недостатком такого липосомального препарата является содержание в композиции человеческого сывороточного альбумина, что приводит к возможному развитию аллергических состояний у больных, длительно применяющих интерферон. Кроме того, метод получения данной композиции предусматривает предварительное растворение липидов, образующих липосому, в органических растворителях, например таких как пропанол, бутанол, циклогексан. Несмотря на последующую лиофилизацию липидной смеси следовые количества этих растворителей могут присутствовать в итоговой лекарственной композиции, вызывая нежелательные побочные эффекты у больных, применяющих препарат. Кроме того, состав данной композиции не обеспечивает возможность получения лиофильно высушенного биологически активного лекарственного средства, пригодного для длительного хранения, что значительно уменьшает возможность применения препарата в медицинских целях.

Известно липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения, содержащее биологически активный компонент - рекомбинантный интерферон-альфа-2 человека, компоненты, формирующие липосомы - фосфатидилхолин и холестерин, стабилизатор - сахарозу, антиоксиданты - альфа-токоферол и аскорбиновую кислоту, представляющее собой лиофилизат или изотонический раствор (патент РФ 2123328, МПК А61К 9/127, опубл. 20.12.98), при следующем соотношении компонентов лиофилизата, мг:

Рекомбинантный интерферон-альфа-2, ME-(2,5-10)×105

Фосфатидилхолин - 60-80

Холестерин - 6-10

альфа-Токоферол - 6-10

Витамин С - 1-2

Сахароза - 40-90.

Такое липосомальное лекарственное средство обеспечивает проявление биологической активности, свойственной интерферону-альфа-2, при пероральном пути введения препарата и достижение терапевтического эффекта от применения этой лекарственной формы без проявления побочных эффектов, сопровождающих парентеральный способ введения интерферона.

Указанное липосомальное лекарственное средство имеет недостаточный срок хранения (активность интерферона альфа-2 практически на постоянном уровне сохраняется не более 12 месяцев).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является липосомальное пероральное противовирусное лечебно-профилактическое средство (патент РФ 2361572, МПК А61К 9/127, опубл. 20.07.2009 г.), включающее рекомбинантный интерферон-альфа-2 человека, фосфатидилохолин, холестерин, альфа-токоферол, лактозу, натрия хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, при этом оно представляет собой лиофилизат при следующем содержании компонентов лиофилизата, мг:

Рекомбинантный интерферон-альфа, ME-(2,5-10)·105

Фосфатидилхолин40,0-42,0
Холестерин4,0-5,0
альфа-токоферол 0,5-0,6
лактоза90,0-92,0
натрия хлорид 7,8-8,1

натрий фосфорнокислый

двузамещенный 12-водный 4,0-5,0

натрий фосфорнокислый

однозамещенный 2-водный 0,5-0,6

Наличие в липосомальной мембране холестерина и витамина Е в заявленных соотношениях обеспечивают относительную стабильность липосом в желудочно-кишечном тракте до места всасывания липидов в организме, и, соответственно, сохранение биологической активности интерферона, заключенного в них.

Однако, такое липосомальное лекарственное средство не очень удобно при фасовке и пероральном применении: препарат фасуют во флаконы при заполнении их инертным газом; непосредственно перед применением флакон с препаратом вскрывают, к содержимому флакона с рекомбинантным альфа-2 интерфероном в липосомальной форме добавляют 1-2 мл дистиллированной или охлажденной кипяченой воды, встряхивают в течение от 1 до 5 мин для образования однородной суспензии. Активность интерферона альфа-2 практически на постоянном уровне сохраняется в течение 24 месяцев.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение более удобной дозированной липосомальной формы рекомбинантного интерферона-альфа-2b человека в капсулах с длительным сроком хранения.

Указанный технический результат достигается тем, что липосомальное противовирусное средство на основе интерферона альфа-2b человека, каждая капсула выполнена в виде полой оболочки с наружным пленочным покрытием, в которой размещены порошкообразный наполнитель и распределенные в наполнителе липосомы, причем, наполнитель состоит из лактозы, натрия хлорида, натрия фосфата двузамещенного 12-водного и натрия фосфата однозамещенного 2-водного, а каждая из липосом выполнена из полой оболочки, содержащей лецитин или фосфатидилхолин, холестерин и альфа-токоферол и расположенного внутри оболочки ядра, включающего рекомбинантный интерферон альфа - 2b человека, при следующем содержании всех компонентов капсулы (мг):

наполнитель:

лактоза146,94-168,18
натрия хлорид13,64-14,00
натрия фосфат двузамещенный 12-водный7,6-8,0
натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,94-1,0

оболочки липосом:

лецитин или фосфатидилхолин 60,38-81,68
холестерин6,64-8,98
альфа-токоферол0,82-1,12

ядра липосом:

Рекомбинантный интерферон-альфа, ME-(2,5-10)105

Оболочка каждой капсулы выполнена из желатина, а наружное покрытие каждой капсулы выполнено из пищевого и фармацевтического полимерного материала, например, Opadry II Yellow (Colorcon 85F38196 или Colorcon 85F32410).

Экспериментальные исследования показали, что концентрации на 1 капсулу лецитина в пределах 60,38-81,68 мг, холестерина в пределах 6,64-8,98 мг и токоферола в пределах 0,82-1,12 мг оптимальны для включения заданного количества рекомбинантного интерферона альфа-2b человека в липосомы со средним размером частиц 0,15 мкм.

Содержание лактозы в диапазоне 146,94-168,18 мг для выше указанного количества липидной композиции обеспечивает стабильное сохранение липосомальной мембраны в процессе лиофилизации и последующего хранения, а ее большее содержание не дает дополнительных преимуществ.

Введение таких компонентов как натрий хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный в заявляемых концентрациях обеспечивает сохранение активности биологически активных веществ (рекомбинантного интерферона альфа-2b человека) на стадии приготовления липосом в капсулированной форме.

Витамин Е (альфа-токоферол), присутствующий в липосомах в заявленных соотношениях, оказывает достаточное антиокислительное и стабилизирующее действие на биологически активные вещества и липидные компоненты.

При использовании интерферона в количестве менее 250 тыс. МЕ выявляется недостаточная клиническая эффективность заявляемой лекарственной формы при пероральном приеме, а увеличение количества интерферона в разовой дозе более 1 млн. ME нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему усилению терапевтического эффекта препарата и может вызвать нежелательные побочные эффекты, характерные для высоких доз интерферона.

Кроме того, лактоза обеспечивает повышение устойчивости готовой лекарственной формы на стадии хранения. Лактоза - невосстанавливающий дисахарид, и поэтому мало подвержена окислению.

Витамин Е (альфа-токоферол), присутствующий в липосомах в заявленных соотношениях, оказывает достаточное антиокислительное и стабилизирующее действие на интерферон и липидные компоненты.

Повышение устойчивости интерферона на стадии приготовления лекарственной формы достигается за счет введения в состав регидратирующего раствора фосфатно-солевого буфера с характеристиками, близкими к таковым у субстанции интерферона, что снижает инактивирующее воздествие таких факторов, как осмоляльность и кислотно-щелочной баланс.

Внешняя оболочка капсулы (в виде пленочного покрытия) также обеспечивает снижение окислительных процессов, отрицательно влияющих на активность интерферона.

На фиг.1 приведена схема капсулы с липосомальной формой интерферона.

На фиг.2 приведена конструктивная схема липосомы.

Каждая капсула выполнена в виде полой оболочки 1 из желатина, в которой размещены порошкообразный наполнитель 2 и распределенные в наполнителе липосомы 3, причем, наполнитель 2 состоит из лактозы, натрия хлорида, натрия фосфата двузамещенного 12-водного и натрия фосфата однозамещенного 2-водного, а каждая из липосом 3 выполнена из полой оболочки 4, содержащей лецитин, холестерин и альфа-токоферол и расположенного внутри оболочки ядра 5, включающего рекомбинантного интерферон альфа-2b человека. Снаружи оболочка 1 капсулы имеет герметичное покрытие 6 в виде полимерной пленки из пищевого и фармацевтически приемлемого материала, например, Opadry II Yellow (Colorcon 85F38196 или Colorcon 85F32410), выпускаемое английской компанией Colorcon.

Вес одной оболочки (1) капсулы из желатина составляет 90-112 мг

Вес покрытия (6) из полимерного материала Opadry II Yellow (Colorcon 85F32410) одной оболочки (1) капсулы из желатина составляет 4,5-5,0 мг.

Ниже приведены примеры составов липосомального средства в капсулах

Пример 1. Состав средства при минимальном содержании всех компонентов капсулы (мг):

Наполнитель (2):

лактоза146,94
натрия хлорид13,64
натрия фосфат двузамещенный 12-водный 7,6
натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,94

оболочки липосом (4):

лецитин60,38
холестерин6,64
альфа-токоферол0,82

ядра липосом (5):

Рекомбинантный интерферон-альфа, ME (2,5)105

Пример 2. Состав средства при среднем содержании всех компонентов капсулы (мг):

Наполнитель (2):

лактоза157,56
натрия хлорид13,82
натрия фосфат двузамещенный 12-водный 7,8
натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,97

оболочки липосом (4):

фосфатидилхолин71,03
холестерин7,81
альфа-токоферол0,97

ядра липосом (5):

Рекомбинантный интерферон-альфа, ME -(5,0) 105

Пример 3. Состав средства при максимальном содержании всех компонентов капсулы (мг):

Наполнитель (2):

лактоза168,18
натрия хлорид14,00
натрия фосфат двузамещенный 12-водный 8,0
натрия фосфат однозамещенный 2-водный 1,0

оболочки липосом (4):

лецитин81,68
холестерин8,98
альфа-токоферол1,12

ядра липосом (5):

Рекомбинантный интерферон-альфа, ME (10,0)105

Технология получения липосомальной формы интерферона в капсулах

В круглодонную колбу (V=20 л), содержащую 400 мл этанола вносят лецитин, растворяют при перемешивании, добавляют холестерин, растворенный в смеси хлороформа с этанолом в объемном соотношении 1:2, перемешивают, добавляют альфа-токоферол, и выпаривают под вакуумом до получения сухой липидной пленки на стенках колбы. После выпаривания продувают липидную пленку инертным газом для предотвращения окисления липидов. Добавляют в колбу раствор субстанции рекомбинантного интерферона альфа-2b человека. Содержимое перемешивают до полной гидратации липидной пленки в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученную липосомальную суспензию подвергают последовательной формирующей и стерилизующей фильтрации через поликарбонатные мембраны фирмы "Nuclepore" (диаметр пор 0,4; 0,2 и 0,1 мкм) под давлением инертного газа (азот, аргон). Далее в полученный полупродукт вводят следующие компоненты: натрия хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, лактозу, воду дистиллированную.

В асептических условиях разливают суспензию в лотки, замораживают при температуре 40°С и проводят лиофильную сушку препарата до достижения остаточной влажности (7±1) мас.%. На 50 л полупродукта получают 8 кг лиофилизированного порошка, который передают на фасовку в твердые непрозрачные желатиновые капсулы с помощью машины ZIBO 40F для автоматического наполнения и закрывания капсул продуктом массой 320 мг. Состав липосомального средства интерферона в капсулах, полученный по выше приведенной технологии представлен в примерах 1-3. На готовые капсулы 1 наносят герметичное покрытие 6 в виде полимерной пленки из пищевого и фармацевтически приемлемого материала, например, Opadry II Yellow Colorcon 85F32410, выпускаемое английской компанией Colorcon.

Средний диаметр липосом, полученных методом экструзии мультиламеллярных везикул через поликарбонатные мембраны и имеющих заявляемый состав, составляет 0,15 мкм.

При анализе антивирусной активности липосомальной суспензии установлено, что не более 25% интерферона остается не инкапсулированным.

Пример 2. Для тестирования in vitro антивирусной активности липосомальной формы интерферона, полученной как указано в примере 1, используют метод подавления цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм "Индиана" в культуре диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (Л-68), выращенной в монослое в 96 - луночных микропланшетах фирмы "Linbro" (Реаферон для инъекций сухой. Фармакопейная статья. ВФС-42-227ВС-89).. Предварительно ВВС пассируют на куриных эмбрионах по ТУ 42-14-97-79, не менее 3-х пассажей (заражающая доза 102-10 3 ТЦД50/0,1 мл при инфекционной активности 10 5-106 ТЦД50/ 0,1 мл). Для контроля степени окисленности липидов используют метод, основанный на измерении концентрации продуктов перекисного окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Yagi K.-Lipid peroxidation. Assay for blood plasma and serum. Methods Enzymol, 1984, vol. 105, p.328-333.).

Перед определением антивирусной активности липосомальную суспензию инкубируют (20±2) мин при температуре (22±1°С) в присутствии 1% (V/V) тритона Х-100 для разрушения липосом. Для определения активности готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) исследуемых препаратов и ОСО активности (активность которого выражена в международных единицах - МЕ-ОСО активности, ФС 42-28-90-87) в среде 199 или Игла с 2%-ной сыворотки плодов коров по ФС 42-7 ВС-85 (поддерживающая среда) и антибиотиками. На каждое разведение используют не менее 4-х лунок с монослоем культуры клеток. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл предполагаемых разведений липосомального интерферона. 4 лунки с культурой клеток оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы индикаторного вируса. В эти лунки вносят по 0,1 мл поддерживающей среды. Инокулированные и контрольные культуры инкубируют в течение 1 сут при (37±1)°С а атмосфере с (5,0±0,5)%СO2, после чего в каждую с испытываемыми материалами вносят определенную заранее дозу ВВС, соответствующую 100 ТЦД50 в 0,1 мл. Одновременно осуществляют контроль взятой дозы вируса на предназначенных для этой цели 16 лунках с культурой. Используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД50, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД50, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубируют на протяжении 2-х суток при температуре, равной (37±1)°С, в атмосфере с (5,0±1)%СО2, под контролем дозы вируса.

Учет результатов противовирусной активности липосомального интерферона осуществляют, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50. Если дозу вируса, соответствующую 100 ТЦД 50, рассчитывают на основании учета результатов через 24 ч после заражения, то и учет титрования препарата осуществляют через 24 ч. Учет результатов опыта возможен, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. За титр липосомального интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказывается полностью защищенной от цитопатического действия вируса. Пересчет активности в ME осуществляют по формуле

Как известно, фармацевтически приемлемым является срок хранения лекарственного средства не менее 6 месяцев, предпочтительнее не менее 1 года. Для подтверждения стабильности лиофильно высушенной липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2-интерферона в капсулах с полимерным покрытием заявленного состава в течение 36 месяцев исследовались противовирусная активность препарата. Препарат хранился в рефрижераторе при температуре 4°С. В течение всего срока наблюдения степень окисленности липидов оставалась неизменной.

Как показали исследования, в течение 36 месяцев хранения не обнаружено снижения противовирусной активности заявляемого лекарственного средства (см. таблицу).

Таким образом, по сравнению с прототипом срок хранения заявляемого препарата альфа-интерферона в липосомальной форме в капсулах с покрытием не изменился.

ТаблицаСравнительные результаты изменения активности интерферона в липосомальной форме, ME на дозу
Срок хранения препаратов, мес 06 1218 2430 36
Прототип (липосомальная форма во флаконах) 500000500000500000 500000500000500000 250000
100000010000001000000 100000010000001000000 650000
Заявляемый препарат (липосомальная форма в капсулах) 500000500000500000 500000500000500000 300000
100000010000001000000 100000010000001000000 650000

Промышленная применимость

Изобретение может быть использовано в медицине в комплексной терапии заболеваний вирусной этиологии и в любых других случаях, при которых показано применение препаратов интерферона.

Липосомальное противовирусное средство на основе интерферона альфа-2b человека в капсулированной форме, включающее капсулу, выполненную в виде полой оболочки из желатина с наружным пленочным покрытием, в которой размещены порошкообразный наполнитель и распределенные в наполнителе липосомы, причем наполнитель состоит из лактозы, а каждая из липосом выполнена в виде полой оболочки и расположенного внутри оболочки ядра, включающего биологически активное вещество, отличающееся тем, что наружное пленочное покрытие каждой капсулы выполнено из полимерного материала Opadry II Yellow Colorcon 85F38196 или Colorcon 85F32410, наполнитель в капсуле дополнительно содержит натрия хлорид, натрия фосфат двузамещенный 12-водный и натрия фосфат однозамещенный 2-водный, материал оболочки липосом выполнен из лецитина или фосфатидилхолина, холестерина и альфа-токоферола, а в качестве биологически активного вещества ядра липосом оно содержит рекомбинантный интерферон альфа-2b человека при следующем содержании всех компонентов капсулы, мг:

наполнитель:
лактоза146,94-168,18
натрия хлорид13,64-14,00
натрия фосфат двузамещенный 12-водный7,6-8,0
натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,94-1,0
оболочки липосом:
лецитин или фосфатидилхолин 60,38-81,68
холестерин6,64-8,98
альфа-токоферол0,82-1,12
ядра липосом:
рекомбинантный интерферон-альфа-2b человека, ME (2,5-10)105



 

Похожие патенты:

Полезная модель относится к масложировой промышленности и может быть использована для получения жидкого лецитина.

Полезная модель относится к области химии, а именно разделения жидких смесей и может применяться в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства

Полезная модель относится к измерительной технике в области ядерной физики, в частности, к альфа-спектрометрическим установкам, предназначенным для исследования альфа-частиц альфа-активного изотопа с известными характеристиками распада изотопов в условиях, когда характерное для измеряемого изотопа альфа-излучение не может быть спектрально выделено в аппаратурном спектре, регистрируемом альфа-спектрометром.
Наверх