Планшет для определения бактериальных эндотоксинов с использованием лал-теста, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов

Полезная модель относится к лабораторным устройствам, в частности, к устройствам для проведения бактериологического теста присутствия бактериальных эндотоксинов с помощью лимулус-амебоцитного лизата (ЛАЛ-теста), а именно к многолуночным планшетам для определения активности бактериальных эндотоксинов в лекарственных средствах для бесприборного высокопроизводительного скрининга с использованием ЛАЛ-теста методом, при котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси; заявляемая полезная модель может быть использована во всех областях, в которых необходим анализ определения активности бактериальных эндотоксинов с использованием ЛАЛ-теста, например, в фармацевтической промышленности для контроля лекарственных средств, в ветеринарии для контроля ветеринарных препаратов, а также в других областях, где требуется анализ для определения активности бактериальных эндотоксинов. Заявляемый планшет состоит из несущей, рабочей части, изготовленной из апирогенного, низкосорбционного материала, которая включает в себя 40 лунок квадратной формы, отделенных друг от друга бортиками. Заявляемый планшет позволяет быстро провести бактериологический анализ присутствия бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста при малом расходе реагентов и возможностью архивации результатов анализа с целью государственной проверки качества анализа лекарственных средств на наличие бактериальных эндотоксинов. 1 н. п. формулы, 3 фиг.

Полезная модель относится к лабораторным устройствам, в частности, к устройствам для проведения бактериологического теста присутствия бактериальных эндотоксинов с помощью лимулус-амебоцитного лизата (ЛАЛ-теста), а именно к многолуночным планшетам для определения активности бактериальных эндотоксинов в лекарственных средствах для бесприборного высокопроизводительного скрининга с использованием ЛАЛ-теста методом, при котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси; заявляемая полезная модель может быть использована во всех областях, в которых необходим анализ определения активности бактериальных эндотоксинов с использованием ЛАЛ-теста, например, в фармацевтической промышленности для контроля лекарственных средств, в ветеринарии для контроля ветеринарных препаратов, а также в других областях, где требуется анализ для определения активности бактериальных эндотоксинов.

В основе ЛАЛ-теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток гемолимфы реликтовых животных - мечехвостов Limulus polyphemus) специфически реагировать с бактериальными эндотоксинами.

В настоящее время ЛАЛ-тест узаконен Фармакопеями многих стран, а с 1997 года введен в Фармакопею РФ [ВФС 42-2960-97 «Определение содержания бактериальных эндотоксинов. ЛАЛ-тест»]. В 2000 году была утверждена Общая фармакопейная статья «Бактериальные эндотоксины» [ОФС 42-0002-00].

Для определения эндотоксина в образцах существует множество полуколичественных и количественных методик проведения ЛАЛ-теста:

- гель-тромб тест, в котором результаты определяются визуально по образованию твердого геля;

- кинетико-турбидиметрический количественный метод, оценивающий помутнение реакционной смеси;

- хромогенный метод, количественная оценка которого связана с появлением окрашивания реакционной смеси в результате расщепления хромогенного субстрата;

- колориметрический метод с использованием определения количества осажденного белка из ЛАЛ-реагента.

Такие известные фирмы как Associates of Cape Code Inc., BioWhittaker Inc., Charles River Endosafe выпускают продукцию, необходимую для проведения ЛАЛ-теста: ЛАЛ-реактивы, воду для проведения ЛАЛ-теста, контрольный стандарт эндотоксина, а также материалы и оборудование - дипирогенизированные пробирки, флаконы для реактивов, пипетки и наконечники для них, автоматические дозаторы, водяные бани, штативы, вихревые мешалки, сухожаровые шкафы, а также многолуночные планшеты.

Известные устройства представляют собой планшет, имеющий множество лунок, не определенных существующими фармакопейными статьями. Лунки имеют цилиндрическую форму и пригодны для проведения иммуноферментных и ферментных реакций хромогенным способом. Лунки используют для размещения образцов раствора, подлежащих анализу.

Хотя эти устройства используются в технике (науке, медицине ветеринарии, биотехнологии) они обладают некоторыми недостатками. Так, лунки

этих испытательных устройств имеют цилиндрическую форму и малый размер, что не позволяет их использовать для проведения реакции фрактализации биополимеров. Высота лунок препятствует равномерному и быстрому высыханию биологических образцов (лимулюс-лизата) и препятствует образованию фракталов самополимеризующихся биологических макромолекул. Их использование возможно для проведения хромогенных и турбидиметрических реакций и требует использования специального дорогостоящего оборудования, что приводит к повышению суммарной стоимости проведения испытаний.

Известен способ определения активности эндотоксина путем смешивания лимулус-лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси [Патент РФ на изобретение №2169367, опубл. 20.06.2001].

Известные устройства - планшеты не подходят определения активности эндотоксина по описанному в этом патенте методу, поскольку лунки этих известных планшетов имеют цилиндрическую форму и малый размер, что не позволяет их использовать для проведения реакции фрактализации биополимеров. Высота лунок препятствует равномерному и быстрому высыханию биологических образцов (лимулюс-лизата) и препятствует образованию фракталов самополимеризующихся биологических макромолекул.

Задачей заявляемого технического решения является создание устройства, пригодного для проведения способа определения бактериальных эндотоксина путем смешивания лимулус-лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси.

Технический результат состоит в возможности проведения реакции фрактализации биополимеров, что достигается применением заявляемого устройства - планшета для определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных средствах путем смешивания лимулус-лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси, состоящем из несущей, рабочей части, изготовленной из апирогенного, низкосорбционного материала, причем несущая, рабочая часть включает в себя 40 лунок квадратной формы, отделенных друг от друга бортиками.

Количество лунок обусловлено существующими фармакопейными статьями (Англия, США, Россия, Украина, Европейский Союз), где предусмотрена постановка 38 анализов на одну серию лекарственного средства. Еще 2 лунки резервные, рассчитанные на дополнительное внесение разведении образца при механической ошибке оператора, использующего устройство.

Заявленное устройство в трех проекциях представлено на фигурах 1-3. Заявляемое устройство состоит из рабочей части 1, которая включает в себя 40 плоских лунок 2 квадратной формы размером 12±1 мм, отделенных друг от друга бортиками 3 высотой 0,5-1,5 мм, которые не препятствуют равномерному и быстрому высыханию биологических образцов (лимулюс-лизата) и образованию фракталов самополимеризующихся биологических макромолекул, а также не препятствуют подведению объектива к рабочей поверхности для оценки образующихся фракталов оптическими приборами. Данный размер является оптимальным, так как этот размер лунки не препятствует образованию фракталов и позволяет экономить дорогостоящие реактивы. Планшет выполнен из стерильного материала, который не адгезирует биополимеры и не содержит на своей поверхности бактериальных эндотоксинов, например, из полистирола или полипропилена, с шероховатостью поверхности

дна лунок Ra 0020, а остальных формообразующих поверхностей - Ra 0080 (в литформе).

Устройство используют следующим образом (определение активности эндотоксина путем смешивания лимулус-лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси в соответствии с Патентом РФ на изобретение №2169367, опубл. 20.06.2001):

Разрывают упаковочный апирогенный стерильный пакет, снимают крышку устройства, и в лунки вносят варипипеткой 2-8 мкл лимулюс-лизата рабочего разведения по числу исследуемых образцов и стандартных разведении эндотоксина. Рабочее разведение лимулюс-лизата готовят согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Сверху на капли лизата наносят такое же количество разведения образцов, или стандарта эндотоксина, закрывают крышкой для предотвращения высыхания и помещают в стерильный термостат при 37°С на 30 мин. Через 30 мин инкубации крышку снимают и оставляют в том же термостате на срок до высыхания смеси реагентов, что в среднем составляет 25-35 мин. Результат учитывают визуально под увеличением ×10-×20. При положительной реакции высушенные пятна смеси реагентов имеют вид "зимнего стекла", "еловой ветви", "снежинки". Учитывают последнее разведение, где еще встречается подобная реакция. Расчет содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве производят согласно ОФС РФ 42-0002-00.

Важным свойством белковых фракталов является то, что в таком виде они сохраняются на протяжении длительного времени, поэтому, упаковав заявленное устройство в пластикатный пакет, можно сохранить результаты анализа в течение длительного времени для архивации результатов анализа с целью государственной проверки качества анализа лекарственных средств на наличие бактериальных эндотоксинов.

Таким образом, заявленный планшет для определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных средствах с использованием ЛАЛ-теста способом, при котором регистрация образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси, может быть эффективно (простота анализа, малый расход реагентов, небольшое время, требующееся для проведения реакции и возможность длительного сохранения результатов) использован во всех областях, в которых необходим анализ определения бактериальных эндотоксинов с использованием ЛАЛ-теста, например, в фармацевтической промышленности для контроля при изготовлении лекарственных препаратов (контроль сырья, воды для инъекций, проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов, контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием, контроль чистоты ампул, флаконов, а также при отработке режимов технологического оборудования); в ветеринарии для контроля ветеринарных препаратов, а также в других областях, где требуется анализ на определение бактериальных эндотоксинов.

1. Планшет для определения бактериальных эндотоксинов с использованием ЛАЛ-теста, в котором регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов, состоящий из несущей, рабочей части, изготовленной из апирогенного, низкосорбционного материала, которая включает в себя 40 лунок квадратной формы, отделенных друг от друга бортиками.

2. Планшет по п.1, отличающийся тем, что длина стороны лунки 12±1 мм.

3. Планшет по п.1, отличающийся тем, что высота бортиков 0,5-1,5 мм.

4. Планшет по п.1, отличающийся тем, что в качестве апирогенного, низкосорбционного материала выбран полистирол или полипропилен, с шероховатостью поверхности дна лунок Ra 0020, а остальных формообразующих поверхностей - Ra 0080 (в лит-форме).