Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов

Полезная модель относится к укладкам для специфической индикации микроорганизмов и токсинов. Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов предназначена для отбора образцов из внешней среды и выявления в них возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (ООИ): сибирской язвы, чумы, туляремии, сапа, а также ботулинического токсина типа А методом иммунохроматографии. Техническим результатом заявленной полезной модели является сокращение процедуры анализа, в т.ч. в процессе исследования смывов с твердых поверхностей, и исключение «ложноположительных результатов» анализов. Заявленный технический результат достигается за счет того, что укладка иммунохроматографических индикаторных элементов, содержащая внутри герметично закрывающегося корпуса: комплекты для отбора образца, комплекты для анализа образца, карандаши, ножницы, пинцет, стеклограф, пакет для стерилизации отходов, перчатки латексные, шильдик, транспортную тару, отличающаяся тем, что содержит в комплекте для отбора проб волосяную кисть, содержит не менее одного индикаторного иммунохроматографического элемента, представляющего собой набор мембран, соединенных в единое целое путем последовательного частичного наложения, помещенный в пластиковую оправу с двумя отверстиями, одно из которых для нанесения пробы, а другое - для наблюдения результатов, и выполненного с возможностью выявления примесей, мешающих проведению иммунохроматографического анализа, содержит мешки с функцией утилизации отходов анализа, их изолирования от внешней среды и стерилизации, при этом каждый комплект содержит все необходимые функциональные компоненты для анализа единичной пробы.

Область применения

Полезная модель относится к укладкам для специфической индикации микроорганизмов и токсинов. Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов предназначена для отбора образцов из внешней среды и выявления в них возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (ООИ): сибирской язвы, чумы, туляремии, сапа, а также ботулинического токсина типа А методом иммунохроматографии.

Уровень техники

Широко известны и весьма выгодны простые, т.н. «безреагентные методы» анализа, работающие при визуальной, либо несложной инструментальной регистрации, охватывающие широкий спектр микроорганизмов и токсинов. Одним из таких методов является иммунохроматография. Специфичность метода обусловлена специфическим иммунохимическим взаимодействием между антителами и антигенами микроорганизмов. Конструктивно типичная тест-система (индикаторный элемент) выполнена в виде пластиковой оправки размером 2×5 см с окошками, внутри которой находится полимерные мембраны с нанесенными на них иммунореагентами. Для сохранности пластиковая оправа с мембраной и одноразовой пипеткой запаяны в многослойный пластиковый пакет с силикагелевым осушителем. При проведении анализа пакет вскрывают. Жидкая анализируемая проба в количестве 100-200 мкл наносится с помощью одноразовой пипетки. В зарубежной научно-технической литературе иногда используется название - «ручной иммунохроматографический анализ» (HHAs - Hand-Held Immunochromatographic Assay).

Наиболее продвинутыми в области создания иммунохроматографических методов и систем для специфической индикации биологических агентов (БА) являются фирмы США. Так, например фирмой «Osborne Scientific» создана укладка Biowarfare Agent Detection Devices (BADD) (Приспособление для обнаружения боевых биологических агентов), позволяющая обнаруживать в объектах внешней среды возбудители сибирской язвы, ботулинический токсин, рицин. Укладка представляет собой чемодан, снабженный

герметически упакованными иммунохроматографическими тестами, для каждого вида БА и имитационными тестами, предназначенными для обучения персонала. Время анализа 3-30 мин., нулевая вероятность ложноположительных результатов при проведении 900 тестов, срок годности 2 года при температуре хранения +20° +50° С. Рабочий диапазон температур положительный.

Фирма Tetracore LLC совместно с фирмой Alextex Technology Inc. предлагает укладку Guardian Bio Threat Alert System (Комплект оповещения о биологической угрозе «Страж»), состоящую из иммунохроматографических тестов для обнаружения спор возбудителя сибирской язвы, рицина, ботулинического токсина, чумы, туляремии, бруцеллеза, стафиллококкового энтеротоксина типа В, вируса натуральной оспы. В укладку также входят имитационные обучающие тесты для персонала, приспособление для сбора образцов, прибор считыватель результатов, позволяющий поднять уровень чувствительности и объективной оценки результатов анализа, сетевой адаптер напряжения к нему, принтер. Одновременно предлагаются сервисные программы, предусматривающие замену тест-систем с истекшим сроком годности, обучение персонала, 3-х летнюю гарантию на прибор-считыватель результатов.

Фирма New Horizons Diagnostics Corp.(США) предлагает, основанный на принципе иммунфокусировки меченных коллоидным золотом антител на мембранах тест - SMART (Sensitive Membrane Antigen Rapid Test - чувствительный мембранный тест по обнаружению антигенов). Эта разновидность иммунохроматографического анализа предполагает стадию взаимодействия антител меченных золотом и искомого антигена в жидкой фазе на стадии подготовки пробы, полученный комплекс конъюгат антител-золото-антиген взаимодействует с мембраной с иммобилизованными вторичными антителами. В результате иммунохимической реакции на мембране, меченные золотом антитела, прореагировавшие с антигенами биологических агентов (БА), фокусируются в виде ярко-красной точки на мембране. Для выявления споровых форм используются стекловолоконные мембраны без вторичных антител. Для оценки положительных результатов может использоваться прибор фотометрии отраженного света. Отмечается, что метод легко автоматизируем, а мембраны содержащие реагенты могут быть изготовлены для индикации широкого спектра БА.

Тесты SMART для выявления спор сибирской язвы применялись вооруженными силами США при проведении операции «Буря в пустыне» в 1991 г.Позднее, для такого же

возбудителя была разработана классическая иммунохроматографическая тест-система - SMART-2. Достоинствами иммунохроматографического метода индикации БА являются: скорость проведения анализа; возможность создания иммунохроматографических тестов для любого типа поражающих человека агентов биологического происхождения - бактериий, риккетсий, вирусов, токсинов; относительная дешевизна и возможность дополнения укладок вновь созданными тест-системами для обнаружения других микроорганизмов или токсинов; отсутствие дополнительных стадий анализа, жидких реактивов; возможность проведения анализа минимально обученным персоналом; возможность как визуальной, так и приборной регистрации результата; хорошая сохранность и "встроенный" контроль качества иммунохроматографических тест-систем; порог детекции по модельным смесям приближающийся к традиционному твердофазному иммунохроматографическому анализу.

Все существующие известные укладки функционально идентичны. Т.е. они анализируют пробу, отобранную из внешней среды путем взятия мазков, сбора неизвестных подозрительных порошков и капель жидкости, последующем растворении их в т.н. «буфере анализа» (определенного состава водном растворе солей, детергентов и белка) и перенесении части полученного раствора (или взвеси частиц) на индикаторный элемент (иногда его называют тест-полоска). Затем, после прохождения реакции, на поверхности индикаторного элемента появляются окрашенные полосы, которые свидетельствуют о наличии искомого микроорганизма, токсина и т.п. вещества в пробе. Отсутствие полос говорит об отсутствии искомого анализируемого вещества.

Индикаторные элементы (тест-полоски) должны быть строго специфичны, т.е. индикаторный элемент для выявления сибирской язвы должен выявлять только возбудителя сибирской язвы, и никакие другие микроорганизмы или токсины.

Тем не менее, проба из внешней среды может содержать: природные кислоты, щелочи, очень мелкие пылевые частицы, детергенты и восстановители и окислители, которые могут мешать протеканию иммунохимических реакций и вызывать появление на поверхности индикаторного элемента (тест-полоске) окрашенных полос даже в отсутствии искомого биологического агента. Это явление называется «ложноположительным результатом» анализа.

Всем известным укладкам присуще явление «ложноположительного результата».

Также недостатком известных решений является то, что они содержат микротампон из

нетканого полимерного материала. При обработке твердых поверхностей для сбора микроорганизмов и токсинов эти материалы малоэффективны. Также недостатком известных решений является то, что каждый иммунохроматографический элемент имеет свой микротампон для сбора образца и свой буфер анализа объемом около 0,4 мл предназначенный для сбора пробы. Отбор проб и анализ на каждом иммунохроматографическом индикаторном элементе происходит последовательно, что удлиняет процедуру анализа.

Техническим результатом заявленной полезной модели является сокращение процедуры анализа, в т.ч. в процессе исследования смывов с твердых поверхностей, и исключение «ложноположительных результатов» анализов.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показано конструктивное устройство укладки, где 1 - комплекты для отбора образца, 2 - комплект для выработки навыков работы оператора, 3 - комплекты для анализа образца, 4 - карандаши, ножницы, пинцет, стеклограф, 5 - пакет для стерилизации отходов, перчатки латексные, 6 - руководство по эксплуатации, 7 - корпус укладки, 8 - шильдик, 9 - транспортная тара (картонный ящик), 10 - пломба. На Фиг.2 показан внешний вид укладки.

Реализация полезной модели

Заявленный технический результат достигается за счет того, что укладка иммунохроматографических индикаторных элементов, содержащая внутри герметично закрывающегося корпуса: комплекты для отбора образца, комплекты для анализа образца, карандаши, ножницы, пинцет, стеклограф, пакет для стерилизации отходов, перчатки латексные, шильдик, транспортную тару, отличающаяся тем, что содержит в комплекте для отбора проб волосяную кисть, содержит не менее одного индикаторного иммунохроматографического элемента, представляющего собой набор мембран, соединенных в единое целое путем последовательного частичного наложения, помещенный в пластиковую оправу с двумя отверстиями, одно из которых для нанесения пробы, а другое - для наблюдения результатов, и выполненного с возможностью выявления примесей, мешающих проведению иммунохроматографического анализа,

содержит мешки с функцией утилизации отходов анализа, их изолирования от внешней среды и стерилизации, при этом каждый комплект содержит все необходимые функциональные компоненты для анализа единичной пробы. В дополнение к индикаторным иммунохроматографическим элементам служащим для выявления возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, сапа и ботулинического токсина типа А каждый комплект для анализа пробы укладки содержит один индикаторный иммунохроматографический элемент (ИИХЭ) для выявления примесей, мешающих проведению иммунохроматографического анализа. ИИХЭ для выявления ложноположительных результатов анализа представляет собой набор мембран, соединенных в единое целое путем последовательного частичного наложения (мультимембранный композит), помещенный в пластиковую оправу с двумя отверстиями: отверстие для нанесения пробы и отверстие для наблюдения результатов. Мультимембранный композит состоит из (в последовательности присоединения мембран друг к другу): впитывающей мембраны из пористой целлюлозы для нанесения изучаемого образца (А), стекловолоконной мембраны (Б), пропитанной раствором конъюгата коллоидного золота с моноклональными антителами (AT1) против микроорганизмов определенного вида, нитроцеллюлозной мембраны (В), на которую нанесены антитела, в виде двух узких полос, находящиеся на определенном расстоянии друг от друга. Первая полоса (аналитическая зона) содержит моноклональные антитела (АТ2), вторая полоса (контрольная зона) кроличьи антимышиные антитела. При этом моноклональные антитела АТ2 не реагируют с микроорганизмами или токсинами, к которым специфичны моноклональные антитела AT1. К концу нитроцеллюлозной мембраны (В) присоединена пористая мембрана для впитывания жидкости (Д). Принцип действия ИИХЭ для выявления мешающих анализу примесей заключается в том, что: жидкий образец, наносится на мембрану для впитывания образца (А), под действием капиллярных сил жидкость, с растворенными в ней примесями проникает в мембрану (Б), на которой находится конъюгат коллоидного золота с AT1 и растворяет его, полученный раствор капиллярными силами перемещается по нитроцеллюлозной мембране (В) к нанесенным полосам антител, и, далее поглощается мембраной для впитывания жидкости (Д).

В том случае, если образец содержит агрессивные химические примеси кислотного, щелочного, окислительно-восстановительного характера, либо механические примеси в

виде наноразмерных пылевых частиц в высокой концентрации, происходит частичное разрушение конъюгата коллоидного золота с антителами, при этом коллоидное золото осаждается в аналитической и контрольной зонах нитроцеллюлозной мембраны (В) в виде окрашенных полос. Появление этих полос свидетельствует о наличии в исследуемой пробе агрессивных химических или наноразмерных механических примесей, способных влиять на образование иммунохимических комплексов [антитела-микроорганизм или токсин], тем самым, вызывая ложноположительный результат. В случае отсутствия в пробе указанных примесей, описанный выше процесс перемещения жидкой пробы происходит без разрушения конъюгата коллоидного золота с антителами и, в результате иммунохимической реакции взаимодействия конъюгата коллоидного золота с мышиными антителами и кроличьими антимышиными антителами в контрольной зоне мембраны (В) образуется окрашенный комплекс [антитело-коллоидное золото-антивидовое антитело], наблюдаемый оператором в виде окрашенной полосы в контрольной зоне ИИХЭ.

Применение ИИХЭ повышает достоверность анализа, за счет исключения ложноположительных результатов. Повышение достоверности анализа влечет за собой и экономические последствия, т.к. исключает проведение дорогостоящих мероприятий по дезинфекции местности, транспорта или изоляции людей вступивших в контакт с предметами зараженными микроорганизмами и токсинами.

Укладка может дополнительно комплектоваться вновь разработанными иммунохроматографическими индикаторными элементами.

В состав «Комплекта для отбора проб» укладки входит волосяная кисть, которая эффективно собирает на микрочешуйках волоса микроорганизмы и токсины при обработке твердых поверхностей.

В укладке применен универсальный буфер анализа, т.е. он подходит для всех типов индикаторных элементов, входящих в нее (в известных аналогах - для каждой тест-полоски свой буфер анализа, отличающийся по химическому составу).

Процедура анализа в укладке включает в себя отбор пробы внешней среды и внесение ее в значительный объем буфера анализа (1,0 мл) и затем параллельное внесение аликвот по 120-150 мкл в 6-ть различных индикаторных иммунохроматографических элементов. Таким образом, спустя 20-30 мин прохождения иммунохимической реакции оператор получает результат сразу по 5-ти видам микроорганизмов и токсинов и убеждается в

отсутствии примесей, могущих вызвать ложноположительные результаты анализа. В укладке применен модульный принцип построения. Укладка содержит:

- отдельный комплект для отбора пробы из внешней среды,

- отдельный комплект индикаторных иммунохроматографических элементов,

- отдельный комплект для элементов выработки навыков работы оператора,

- отдельно имеются мешки для утилизации отходов анализа (их изолирования от внешней среды и стерилизации.

При этом каждый комплект содержит все необходимые функциональные компоненты. Это увеличивает степень удобства работы с укладкой, так как для анализа единичной пробы можно воспользоваться не всей укладкой, а оперировать только комплектом для отбора образца и комплектом для анализа образца.

Укладка позволяет увеличить номенклатуру определяемых возбудителей особо опасных инфекций и токсинов до 5 наименований в едином цикле анализа.

Укладка эксплуатируется в стационарных условиях или в составе передвижных лабораторий и рассчитана на проведение отбора и анализа 10 образцов. Работа с укладкой во время движения не предусмотрена. Каждая укладка эксплуатируется одним оператором.

Область применения: выявление возбудителей ООИ и ботулинического токсина типа А в образцах, взятых из объектов внешней среды (смывов с поверхностей различных предметов), или жидких пробах, полученных при культивировании микроорганизмов на питательных средах.

Корпус укладки может быть выполнен в виде пластикового кейса и предназначен для хранения и транспортировки комплектующих укладки. Комплект для выработки навыков работы оператора предназначен для предварительного обучения персонала основным навыкам работы с укладкой и интерпретации полученных результатов анализа.

Комплект для отбора образца предназначен для отбора одного образца и доставки его к месту анализа, а также для отбора одного контрольного образца для его последующего анализа референтными методами.

Комплект для анализа образца предназначен для проведения анализа и содержит индикаторный иммунохроматографический элемент (ИИХЭ) для выявления возбудителей ООИ, а так же ИИХЭ для выявления примесей, вызывающих

ложноположительные результаты иммунохроматографического анализа. При работе используют вспомогательные комплектующие компоненты укладки: перчатки, ножницы, карандаш, стеклограф, мешки для утилизации биоматериалов после проведения анализа, бланк направление.

На пластиковый кейс нанесен шильдик с указанием:

- логотип предприятия изготовителя;

- полное и сокращенное наименование укладки;

- номера настоящих технических условий;

- заводской номер укладки.

Принцип работы укладки

Оператор открывает укладку, достает пакет с комплектом для выработки навыков работы оператора и вскрывает его при помощи ножниц. Комплект для выработки навыков работы оператора с укладкой может содержать ИИХЭ положительный контроль - 3 шт, ИИХЭ отрицательный контроль - 3 шт, пластиковую пипетку Пастера, пробирку с 2 мл буфера анализа.

Оператор достает из пакета одну ИИХЭ для выработка навыков работы оператора положительный контроль и одну ИИХЭ для выработка навыков работы оператора отрицательный контроль, пробирку с буфером анализа, пластиковую пипетку Пастера. Затем вскрывает пакеты с ИИХЭ и кладет пластиковые оправы на ровную горизонтальную поверхность. Открывает пробирку с буфером анализа и набирает в пипетку буфер. Засекает время по секундомеру. Капает в обе ИИХЭ по одной капле в отверстия для нанесения образца (отверстие промаркировано латинской буквой «s» на поверхности пластиковой оправы). Спустя 30-45 секунд оператор капает на те же отверстия еще по одной капле. Всего требуется внести в каждый ИИХЭ 5-6 капель с интервалами 30-45 секунд. Результаты анализа регистрируют спустя 25 мин.

В ИИХЭ положительный контроль должны образоваться две окрашенные линии одна в аналитической зоне (промаркирована латинской буквой «t» расположенной на поверхности пластиковой оправы) и вторая на контрольной зоне (промаркирована латинской буквой «с» расположенной на поверхности пластиковой оправы).

В ИИХЭ отрицательный контроль должна образоваться только одна окрашенная линия в контрольной зоне.

Перед началом работы с укладкой необходимо проверить комплектность по таблице руководства по эксплуатации. При внесении укладки с мороза в отапливаемое помещение ее компоненты должны быть приведены в соответствие с температурой помещения, во избежание конденсации влаги на внешних поверхностях ИИХЭ. Непосредственно перед выходом на объект для отбора образцов оператор достает и вскрывает ножницами требуемое количество пакетов с комплектом для отбора образца, карандашом заполняет бланки направления и при необходимости маркирует при помощи маркера пробирки с буфером анализа, а также достает пакет для стерилизации и, при необходимости, пинцет.

Отбор образцов предположительно содержащих возбудителей ООИ или ботулинический токсин типа А проводят в индивидуальных средствах защиты (противохимические или противочумные костюмы 1-го типа, либо резиновые перчатки, ватно-марлевая повязка предохраняющая органы дыхания, очки, халат, бахилы).

Отбор образцов из объектов внешней среды проводят с твердых поверхностей: поверхность столов, пола, стен, экранов мониторов и телевизоров, зеркал, стекол, листьев и стволов деревьев, поверхности фруктов и овощей. Отбор образца заключается в следующем. Оператор, прибыв на место, достает заранее вскрытый пакет с комплектом для отбора образца, достает из него промаркированную пробирку с буфером анализа и кисть. Периодически, смачивая кисть в буфере анализа и отжимая избыток жидкости о края пробирки, оператор проводит кистью по исследуемой поверхности. При этом клетки возбудителей ООИ или ботулинический токсин переносятся в пробирку. Отбор жидких образцов производят сухой кистью, отжимая кисть о внутренние края пробирки. Площадь с которой отбирается образец должна составлять приблизительно 100 см² (10×10см). В пробирке после окончания отбора образца должно оставаться не менее 1,2 мл жидкости. После окончания отбора пробирку герметично закупоривают крышкой. Использованную кисть помещают в пакет для комплекта для отбора образца. Пробирку с отобранным образцом и пакет для отбора образца помещают в пакет для стерилизации биологических отходов и завязывают на пакете узел. В таком виде образец (образцы) транспортируются к месту анализа образца. Комплект для отбора образца содержит стерильную пробирку и сухой тампон для взятия мазка и последующего микробиологического анализа. Мазки для микробиологического анализа необходимо брать до взятия проб для иммунохроматографического анализа, т.к. жидкий буфер анализа для

иммунохроматографии содержит биоцидное вещество - азид натрия.

Оператор достает из укладки и вскрывает ножницами пакет с пластиковой пипеткой Пастера, пакет для анализа образца. Затем достает из пакета пакеты с ИИХЭ, вскрывает их и кладет на ровную горизонтальную поверхность. Каждый ИИХЭ кладут на тот пакет, в котором он был упакован. Затем оператор достает отобранный ранее образец и набирает его в пипетку.

Анализ образца проводят следующим образом. Образец капают в отверстие в пластиковой оправе, промаркированное латинской буквой «s». Во все ИИХЭ капают по одной капле образца и выжидают 30-45 секунд. Процедуру повторяют. Всего в каждый ИИХЭ вносят 5-6 капель образца с интервалами 30-45 секунд. В процессе анализа на поверхности мембраны ИИХЭ формируются окрашенные линии в аналитической зоне (промаркирована латинской буквой «t» расположенной на пластиковой оправе) и контрольной зоне (промаркирована латинской буквой «с» расположенной на пластиковой оправе). Результат регистрируют визуально спустя 25 мин.

После проведения анализа все образцы, посуда, пипетки должны быть уложены в пластиковый пакет для утилизации биологических отходов и подвергнуты стерилизации при температуре плюс 160°С в течении 60 мин.

Учет результатов анализа проводят на следующей основе. Положительный результат анализа - на поверхности мембраны образовались две окрашенные линии.

Отрицательный результат - на поверхности мембраны образовалась одна окрашенная линия в контрольной зоне. ИИХЭ непригодный для анализа - на поверхности мембраны не образовалось ни одной окрашенной линии.

Если в исследуемом образце присутствует возбудитель ООИ или токсин, в запредельных от нормы концентрациях, то в соответствующем ИИХЭ будет наблюдаться положительный результат анализа.

Если в ИИХЭ для выявления примесей, вызывающих ложноположительные результаты иммунохроматографического анализа, наблюдается положительный результат анализа, то показания остальных ИИХЭ не учитываются.

При попадании в аварийные условия эксплуатации оператор должен поместить отобранные образцы в укладку, закрыть пластиковый кейс и покинуть место аварии.

Поэтому корпус укладки выполнен герметичным.

Укладка в транспортной таре может транспортироваться любым видом транспорта в

крытых вагонах или контейнерах при температуре от плюс 5 до плюс 35°С. В открытых автомашинах транспортный ящик с укладкой закрепляют подручными средствами от перемещений и ударов, укрывают брезентом от осадков.

Для перевозки укладки и комплекта пополнения без транспортного ящика (на малые расстояния) дополнительной защиты не требуется.

Комплектующие элементы изготовлены из химически и биологически инертных материалов (нитроцеллюлоза, ударопрочные пластмассы, сталь, полипропилен, неорганические соли) и непосредственной опасности здоровью не представляют. По окончании эксплуатации комплекта их утилизируют общепринятыми способами, основанными на требованиях экологии.

Укладка, содержащая внутри герметично закрывающегося корпуса комплекты для отбора образца, комплекты для анализа образца, карандаши, ножницы, пинцет, стеклограф, пакет для стерилизации отходов, перчатки латексные, шильдик, транспортную тару, отличающаяся тем, что содержит в комплекте для отбора проб волосяную кисть, содержит не менее одного индикаторного иммунохроматографического элемента, представляющего собой набор мембран, соединенных в единое целое путем последовательного частичного наложения, помещенный в пластиковую оправу с двумя отверстиями, одно из которых для нанесения пробы, а другое - для наблюдения результатов, и выполненного с возможностью выявления примесей, мешающих проведению иммунохроматографического анализа, содержит мешки с функцией утилизации отходов анализа, их изолирования от внешней среды и стерилизации, при этом каждый комплект содержит все необходимые функциональные компоненты для анализа единичной пробы.