Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах

Клеточный имплантат представляет собой объемную трехмерную тканеинженерную конструкцию, содержащую основу - матрицу-носитель и клеточные элементы: аллогенные клетки мезенхимы, эпителия и нейральные клетки. Основа имплантата выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, которая, в зависимости от метода сушки, может иметь различные формы: в виде геля, губки или сетчатой формы. Внутри коллагеновой структуры матрицы-носителя расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки. В объеме коллагеновой структуры распределены клетки мезенхимы человека и нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза. Сверху поверхность имплантата покрыта клетками эпителия человека. Используемая в составе клеточного имплантата популяция из 3-х типов клеток является сбалансированной по биологической совместимости, что обеспечивает синергизм в действии клеток имплантата по их влиянию на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и создает оптимальные условия для активации процессов регенерации тканей. За счет особенностей клеточного состава и структуры заявленного имплантата обеспечивается его хорошая приживляемость в зоне дефекта, быстрое прорастание имплантата новообразуемой тканью и регенерация поврежденных аксонов. Технический результат, получаемый при использовании заявленного клеточного имплантата, заключается в повышении эффективности лечения путем комплексного воздействия на зону повреждения, полноценного замещения и регенерации дефектов тканей и органов с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.

Полезная модель относится к медицине, медицинским и клеточным технологиям, а именно к тканеинженерным конструкциям, предназначенным для восстановления структуры и функций тканей и органов. Клеточный имплантат может быть использован для хирургического лечения травматических повреждений кожных покровов, мягких тканей, частей органов, например, при ожогах, отморожениях, флегмонах мягких тканей, оперативных вмешательствах, а также для лечения трофических язв и других поражений тканей и органов, протекающих на фоне длительной ишемии, нейрональной дегенерации, атрофии или нарушении целостности периферических нервов.

Разработка живых эквивалентов тканей (тканеинженерных конструкций) и их использование в виде имплантатов при хирургической пластике является одним из наиболее перспективных способов восстановления целостности поврежденных или утраченных тканей и органов. Основной принцип лечения путем трансплантации клеточных имплантатов заключается в доставке к месту повреждения малодифференцированных донорских клеток, которые способны закрывать дефекты тканей и органов, оказывать индуктивные и стимулирующие влияния на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента, активизировать репаративные процессы в тканях, что приводит к восстановлению утраченной или поврежденной ткани в месте трансплантации.

К настоящему времени разработаны тканеинженерные конструкции для восполнения дефектов в тканях различного генеза. Однако их применение не всегда эффективно, главным образом, из-за недостаточности нейрорегенерации.

Как известно, для успешного протекания регенерационных процессов необходим высокий уровень нейротрофических и нейроростовых факторов, который отсутствует в области травматических или трофических поражений. Существующие клеточные имплантаты обладают, в основном, ранозаживляющим действием и не позволяют добиться восстановления местных нарушений иннервации в тканях. Данная проблема может быть преодолена за счет включения в состав имплантатов нейральных клеток, которые обладали бы способностью дифференцироваться в нейральном направлении и вызывать рост и регенерацию аксонов в поврежденной ткани.

Сдерживающим фактором в получении эффективных клеточных имплантатов, пригодных для восстановления иннервации и дефектов в тканях и органах, является отсутствие приемлемого источника нейральных стволовых клеток.

Известна биологическая конструкция для возможной имплантации в организм человека при терапии болезненных состояний или состояний при повреждении тканей, содержащая мезодермальные клетки, которые культивируют без помощи каркаса или чужеродного матрикса с высокой плотностью посева на единицу площади сосуда для культивирования в диапазоне от 3,33×10⁵ до 3×10⁶ клеток на см², что приводит к возникновению трехмерного подобного ткани формирования или организации клеток. Мезодермальные клетки выбирают из клеток фибробластов, включая фибробласты кожи, остеобластов, жировых стромальных клеток и хондроцитов (Патент RU 2335538, C12N 5/06, 10.04.2008).

Недостатком известной биологической конструкции является относительно быстрое вымывание имплантируемых клеток с транссудатом из раны, что не позволяет добиться полной активации регенераторного потенциала имплантата.

Известен универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, причем один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса, например, класса млекопитающих и класса птиц, и состоящий из двух фаз: твердой - в виде микрогранул из коллагена ткани млекопитающих и жидкой - из денатурированного коллагена ткани птиц. В состав матрикса включены также эмбриональные клетки нервной ткани. Универсальный матрикс предназначен для восстановления повреждений мягких тканей и органов путем имплантации. Эмбриональные нервные ткани способны приживляться и устанавливать синаптические контакты с нейронами реципиента (Патент RU 2249462, A61K 38/39, 10.04.2005).

Недостатками данного имплантата являются, с одной стороны, морально-этические аспекты при извлечении эмбриональных нервных клеток человека, а с другой стороны присутствие коллагена ткани птиц повышает процент отторжения имплантата.

В силу ряда биологических и технологических ограничений эмбриональные стволовые клетки и эмбриональные ткани человека не могут быть рассмотрены в качестве потенциальных перспективных нейральных имплантатов. Кроме того, такой подход не принимается общественностью цивилизованных стран, осуждается религиозными и общественными деятелями.

Известна также имплантируемая нейроэндопротезная система для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, представляющая собой упругоэластичную клеточно-биополимерную биологически активную массу, полученную из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента, в частности, нейральных стволовых клеток, нейроглиальных обкладочных клеток, эндотелиальных клеток с маркером CD34+и очищенных мононуклеаров. Указанная биосистема может дополнительно содержать стимуляторы клеточной регенерации и факторы роста нервов и сосудов (Патент RU 2394593, A61K 38/39, опубл. 20.07.2010).

К недостаткам известной нейроэндопротезной системы относится то, что она не является универсальной, поскольку предназначена для восстановления узкоспециализированной ткани: для восполнения дефектов нервной ткани в центральной и вегетативной нервной системе.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является клеточный имплантат - активный биологический комплекс для органогенеза, представляющий собой многокомпонентную трехмерную коллагеновую структуру, содержащую аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия человека и, по крайне мере, один слой из биосовместимого полимера в виде сетчатой матрицы внутри коллагеновой структуры. Коллагеновая структура формирует трехмерную основу имплантата - матрицу-носитель и может быть выполнена в различных формах, например, в виде геля, губок или сетчатой формы. Коллагеновая структура может включать белки внеклеточного матрикса, факторы роста, антисептики и другие компоненты, необходимые для роста клеток новой ткани. Клетки мезенхимы, в частности фибробласты человека, распределены в объеме коллагеновой структуры и служат компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации соединительной ткани. Клетки эпителия, в качестве которых используются постнатальные кератиноциты кожи человека, являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации эпителиальной ткани. Данный имплантат предназначен для регенеративной и репаративной реконструкции любых биологических структур, имеющих мезенхимо-эпителиальное или мезодермальное и эктодермальное происхождение, в частности, дефектов пищевода, стенки мочевого пузыря, кожных покровов, гортани, трахеи, почек, внутренних половых органов, конъюнктивы и орбиты глаза, носовой перегородки, носоглотки и среднего уха и т.п. (Патент RU 2254146, A61L 27/24, опубл. 20.06. 2005).

К недостаткам ближайшего аналога относится отсутствие в структуре имплантируемой конструкции клеточных компонентов активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани, что не позволяет восстановить рост поврежденных аксонов нервных клеток и иннервацию в зоне дефекта.

Задачей, на решение которой направлена предлагаемая полезная модель, является разработка универсального имплантата для замещения и регенерации поврежденных или утраченных тканей и органов с восстановлением в них иннервации, включая восстановление поверхностной тактильной чувствительности.

Технический результат, получаемый при использовании заявленного клеточного имплантата, заключается в повышении эффективности лечения путем комплексного воздействия на зону повреждения, полноценного замещения и регенерации дефектов тканей и органов с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.

Технический результат достигается тем, что клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах, выполненный в виде объемной трехмерной тканеинженерной конструкции, включает аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия и матрицу-носитель, основа которой выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки, при этом клетки мезенхимы расположены внутри матрицы-носителя, клетки эпителия на ее поверхности, а в структуру матрицы-носителя дополнительно включены нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза.

Для достижения указанного технического результата заявленный имплантат выполнен, как и в прототипе, из многокомпонентной коллагеновой структуры, образующую объемную трехмерную матрицу-носитель, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки; содержит клеточные элементы- клетки мезенхимы, расположенные внутри матрицы-носителя, и клетки эпителия, нанесенные на ее поверхность. В качестве клеток мезенхимы в состав имплантата входят аллогенные фибробласты человека, а клеток эпителия - аллогенные клетки эпидермиса кожи человека (кератиноциты).

В отличие от прототипа, в коллагеновую структуру матрицы-носителя имплантата дополнительно включены нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, которые распределены внутри матрицы-носителя.

Используемые для создания тканеинженерной конструкции нейральные прогениторные клетки человека, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, предрасположены к направленной пролиферации, миграции, изменению фенотипа и к проявлению клетками пронейральных свойств (RU 2409663, C12N 5/071, опубл. 20.01.2011). Это позволило создать имплантат с действенным компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани, обеспечивающим регенерацию и рост поврежденных аксонов нервных клеток в зоне дефекта, что необходимо для формирования полноценной новой ткани.

Кроме того, используемая в составе клеточного имплантата популяция из 3-х типов клеток (клеток мезенхимы, клеток эпителия и нейрональных прогениторных клеток, выделенных из ретинального пигментного эпителия глаза), является сбалансированной по биологической совместимости, что обеспечивает синергизм в действии клеток имплантата по их влиянию на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и создает оптимальные условия для активации процессов регенерации тканей. За счет особенностей клеточного состава и структуры заявленного имплантата обеспечивается его хорошая приживляемость в зоне дефекта, быстрое прорастание имплантата новообразуемой тканью и регенерация поврежденных аксонов.

Следует также отметить, что источником нейральных прогениторных клеток человека является ретинальный пигментный эпителий глаза, что снимает многие этические проблемы, связанные с использованием эмбриональных тканей человека.

Сравнение предлагаемого клеточного имплантата для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах с другими тканеинженерными конструкциями, известными в области медицины, показало его соответствие критериям полезной модели. Все элементы заявляемого клеточного имплантата являются однозначно идентифицируемыми, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость». При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к клеточным имплантатам для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах, которым присущи все существенные признаки заявленной полезной модели, что свидетельствует о соответствии критерию «новизна».

Кроме того, для решения поставленной задачи включение в структуру основы имплантанта нейральных прогениторных клеток человека, выделенных из ретинального пигментного эпителия глаза, не является очевидным решением для специалистов в области медицины, медицинских технологий и биоинженерии.

Применение предлагаемого клеточного имплантата для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах позволит получить следующие преимущества:

- повысить регенеративную способность имплантата с восстановлением поверхностной дискриминационной тактильной чувствительности раневой поверхности мягких тканей;

- снизить объем оперативного вмешательства при лечении ожогов, трофических язв и длительно не заживающих ран; травмах при сопутствующих парезах, травмах периферических нервов, длительно существующей ишемии, и повысить функциональные возможности (чувствительность) восстановленного кожного покрова и, тем самым, улучшить физиологический и психологический уровни восприятия жизни пациентов;

- обеспечить адекватное постоянное закрытие обширных поверхностей и повысить эффективность лечения и реабилитации пациентов с обширными глубокими ожогами;

- проводить безоперационное местное лечение ран у людей пожилого и старческого возраста с тяжелыми сопутствующими заболеваниями и у людей в тяжелом состоянии, у которых по медицинским показаниям не может быть выполнена операция аутодермопластики.

Полезная модель иллюстрируется графическими материалами, где на фиг.1 представлен общий вид клеточного имплантата.

Имплантат представляет собой трехмерную тканеинженерную конструкцию, образованную многокомпонентной коллагеновой структурой матрицы-носителя (1), внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки (2). В объеме коллагеновой структуры распределены клетки мезенхимы человека (3) и нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза (5). Сверху поверхность имплантата покрыта клетками эпителия человека (4).

Детальное описание полезной модели.

Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах представляет собой объемную трехмерную тканеинженерную конструкцию, содержащую основу - матрицу-носитель и клеточные элементы: аллогенные клетки мезенхимы, эпителия и нейральные клетки.

Основа имплантата выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, которая, в зависимости от метода сушки, может иметь различные формы: в виде геля, губки или сетчатой формы. Предпочтительно коллагеновая структура содержит 0,1-0,15% раствор коллагена в 0,1% уксусной кислоте.

Коллагеновая структура матрицы-носителя содержит компоненты, необходимые как для поддержания клеточных элементов имплантата, так и для роста клеток новой ткани: десятикратный концентрат культуральной среды «199» в количестве от 7% до 40% от объема, предпочтительно от 10% до 20%; глутамин в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, предпочтительно от 0,1 до 0,4 мг/мл; бикарбонат натрия в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, предпочтительно от 0,25 до 0,4 мг/мл; фосфатный буфер в количестве от 0,01 до 0,1 мг/мл от объема, предпочтительно от 0,01 до 0,05 мг/мл.

Дополнительно в коллагеновую структуру имплантата могут быть включены белки внеклеточного матрикса, в качестве которых могут быть использованы фибронектин, и/или ламинин и/или белок в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, предпочтительно в концентрации от 1 до 5 мкг/мл.

Коллагеновая структура имплантата может также дополнительно содержать факторы роста. В качестве факторов роста могут быть использованы эпидермальный фактор роста, и/или фактор роста фибробластов, и/или трансформирующий фактор роста и и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, предпочтительно в концентрации от 1 до 100 нг/мл.

Коллагеновая структура имплантата дополнительно может содержать также антисептики, такие как, например, ионы серебра, меди и золота; антибиотики, такие как, например, гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, предпочтительнее в концентрации от 0,1 до 0,2 мг/мл, и/или любые другие антибиотики широкого спектра действия.

При необходимости коллагеновая структура может включать в себя пластификатор, обычно в количестве от 0,05 до 10 мас.%. Пластификатор выбирают, как правило, из группы полиэтиленгликоля, сорбита, глицерина и т.п.

Коллагеновая структура имплантата выполняет функцию носителя клеток и биологически активных компонентов. В готовом виде она имеет трехмерную форму и обладает характеристиками, соответствующими естественному микроокружению фибробластов, эпителиальных клеток и нейральных клеток in vivo. Белки внеклеточного матрикса и факторы роста способствуют процессам миграции, дифференцировки, пролиферации и активизации основных функций клеточных элементов имплантата, что, в свою очередь, позволяет добиваться ускорения процессов регенерации поврежденных тканей и органов.

Внутри коллагеновой структуры матрицы-носителя расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки.

Указанный сетчатый слой может быть выполнен, например, из викриловой сетки с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм или ее равноценного заменителя по свойствам: биосовместимость и эластичность.

Сетчатый слой, размещенный, в толще коллагеновой структуры, выполняет каркасную функцию, препятствует процессу сжатия имплантата и значительно упрощает процедуру его перенесения на рану пациента.

В качестве аллогенных клеток мезенхимы в составе имплантата используют фибробласты человека, выделенные из донорской кожи или мезенхимные стволовые клетки, выделенные из костного мозга, жировой ткани или иного донорского материала. Клетки мезенхимы предварительно культивируют in vitro и равномерно распределяют внутри коллагеновой структуры. Аллогенные клетки мезенхимы являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации соединительной ткани и кровеносной системы, а также клеток мезодермы, из которых образуются поперечно-полосатая мускулатура, например почки, внутренние половые органы и т.п.

В качестве аллогенных клеток эпителия в состав имплантата входят клетки эпидермиса кожи человека - кератиноциты, выделенные из биоптатов кожи реципиента, или донора после пластических операций, или их смесь. Клетки эпителия предварительно культивируют in vitro и наносят в виде суспензии на поверхность коллагеновой структуры. Аллогенные клетки эпидермиса являются компонентом активации и формирования процесса регенерации эпителиальных тканей.

В качестве нейральных прогениторных клеток в состав имплантата входят дедифференцированные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза. Нейральные прогениторные клетки предварительно культивируют in vitro, и равномерно распределяют внутри коллагеновой структуры. Нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза, являются компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации нервной ткани.

Таким образом, предлагаемый клеточный имплантат предоставляет в зоне трансплантации все условия, необходимые для производства ткани, делая возможным размножение, созревание и связывание необходимых для этого клеток с желаемой гистологией, при этом нейральные факторы работают в тандеме с факторами васкуляризации, что создает важные предпосылки для стимуляции трофики в поврежденном органе и ткани.

Заявленный клеточный имплантат можно производить серийно в промышленном масштабе для создания банка эквивалентов донорских тканей.

В случае, если клеточный имплантат был изъят из криохранилища, необходимо проверить жизнеспособность клеток, прошедших криоконсервирование, например, путем окрашивания пробы клеток трипановым синим или другим красителем, позволяющем отличить жизнеспособные клетки от погибших. При этом количество жизнеспособных клеток должно быть не менее 70% от их общего количества. Перед проведением дальнейших манипуляций клеточный имплантат необходимо в течение 30-40 минут выдержать при 37°C.

Пример 1. Приготовление клеточного имплантата для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах.

А. Приготовление раствора коллагена.

Коллаген I типа получают из сухожилий хвостов лабораторных крыс весом 200 г. Ампутированные хвосты погружают в 70% этанол на 1-2 ч. Все дальнейшие операции проводят в стерильных условиях. С помощью пинцета и ножниц отделяют сухожилия и помещают их в 0.1%-ный раствор уксусной кислоты. Для приготовления 1 л раствора коллагена используют сухожилия из 10 хвостов.

Экстракцию коллагена проводят при +4°C в течение 48 ч, после чего раствор центрифугируют при 2500 об/мин (2 ч, +4°C). Затем супернатант сливают в стерильную посуду и хранят при +4°C. Массовую долю коллагена в полученном растворе определяют при помощи высушивания до постоянного веса.

Б. Получение культур клеток постнатальных фибробластов кожи человека и кератиноцитов кожи человека.

Фибробласты культивируют на среде (полная ростовая среда): DMEM (Панэко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, HyClone, USA). 0,32 мг/мл глутамина. Пересев осуществляют при достижении монослоя, при помощи растворов Версена и трипсин-Версена.

Кератиноциты культивируют на среде (полная ростовая среда для кератиноцитов): DMEM/F12 (Панэко, Россия), 10% FBS (HyClone, USA), EGF 10 ng/ml, инсулин 5 µg/ml, трансферрин 5 µg/ml, изопротеринол 10 mM, глугамин 0,32 mg/ml. Пересев на коллагеновые микроносители осуществляют по достижению монослоя, при помощи растворов Версена и трипсин-Версена.

Г. Получение культуры нейральных прогениторных клеток из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека.

Выделение клеток ретинального пигментного эпителия осуществляют из трупных тканей глазных яблок человека. Для этого предварительно выделенное целое цилиарное тело глаза обрабатывают в течение 10 минут ферментным препаратом Accutase (Sigma, USA) при температуре 37°C. Механически удаляют строму и эпителий и разбивают ткань на отдельные клетки путем длительного пипетирования. Далее проводят ферментативную обработку гиалуронидазой (Hialuronidase (Sigma, USA)) и коллагеназой (Collagenase IV(Sigma, USA)) в течение 8 минут при температуре 37°C. Тройную отмывку от ферментов и получение суспензии отдельных клеток осуществляют кратковременным пипетированием.

Культивирование клеток проводят на двух средах: безсывороточной и сывороточной. При культивировании в безсывороточной среде используют среду NeuroCult с добавлением NeuroCult proliferation supplement (StemCell Technologies Inc, USA), и 20 ng/ml EGF(Sigma, USA), 20 ng/ml FGF-2(Sigma, USA), and 2 µg/ml Hepari (Sigma, USA) n, 0.1 g/l penicillin/streptomycin (Sigma, USA). Посев клеток осуществляют в 24-луночных платах в количестве 5×10⁴ клеток /1.5 ml, и культивируют при температуре 37°C и атмосфере с 5% CO₂. Частичную замену среды производят каждые два дня.

В сывороточной среде DMEM/F12 клетки ретинального пигментного эпителия культивируют с добавление 2% N2 (Sigma, USA), 20 ng/ml EGF (Sigma, USA), 20 ng/ml FGF-2(Sigma, USA), 2 µg/ml Heparin(Sigma, USA), 2 mM L-Glutamine(Sigma, USA), 0.1 g/l penicillin/streptomycin (Sigma, USA) and 1% fetal bovine serum (FBS), в 24-луночных платах в количестве 5×10⁴ клеток / 1.5 ml, при 37°Cи атмосфере с 5% CO₂. Частичную замену среды производят каждые два дня. Полученные нейросферы пассируют каждые 1-2 недели после образования при помощи ферментов Accutase.

Полученную клеточную культуру анализируют с использованием маркеров клеточного фенотипа и дифференцировки: nestin, vimentin, beta-tubulin III, neurofilaments, Ki-67, GFAP, recoverin calbindin, Th, CRALB, Cx43, Рах6, Oct4, Nanog.

Д. Изготовление клеточного имплантата.

Коллагеновый гель получают простым смешиванием всех его компонентов при температуре 0-(+4)°C.

Стерильный 0,34М раствор NaOH соединяют с концентрированной (×10) культуральной средой 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляют 100 мг глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone, USA) и 9 мл 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. В случае необходимости заменяют 10% FBS на среду DMEM равного объема. При необходимости к основным компонентам коллагенового геля вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики.

В случае лечения раневых поверхностей значительной площади или наличия сопутствующего заболевания, препятствующего процессу восстановления дефекта, в состав коллагеновой структуры имплантата дополнительно могут быть внесены ростовые факторы, влияющие на активность клеток, в том числе: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста и (TGF), фактор роста, выделяемый тромбоцитами (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) или их сочетания в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл.

Полученную смесь соединяют с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1:4 на ледяной бане для предотвращения преждевременной полимеризации. Получают коллагеновую структуру имплантата в форме коллагенового геля.

При желании коллагеновая структура имплантата может быть получена в форме губки. Для этого коллагеновый гель, изготовленный так, как описано выше, подвергают сублимационной сушке до сохранения содержания воды в пределах от 2 до 6%.

Сетчатую форму коллагеновой структуры имплантата получают путем заливки коллагенового геля в специальные формы с последующей сушкой при комнатной температуре.

По завершении процесса изготовления коллагеновой структуры имплантата в нее вносят суспензию фибробластов с концентрацией 75-100 тыс.кл./мл, суспензию нейральных стволовых клеток с концентрацией 75-100 тыс.кл./мл и ресуспендируют.

В емкости, предназначенные для изготовления имплантата, размещают полимерную сетку заданного размера и разливают еще не застывший гель со смесью клеток. Гель полимеризуют при 37°C в течение 10-20 мин. После полимеризации геля, для создания полноценного имплантата, на поверхность наносят суспензию кератиноцитов в концентрации 2*10⁵ кл/см² и культивируют в полной ростовой среде для кератиноцитов. Через 3 суток на поверхности геля образуется монослой эпителиальных клеток.

Полученный клеточный имплантат может быть подвержен криоконсервации в жидком азоте и оставлен для сохранения при отрицательных температурах на срок до 1 года.

Пример 2. Использования клеточного имплантата для замещения и регенерации тканей.

Экспериментальные исследования по изучению влияния трансплантации клеточного имплантата на регенерационные процессы в поврежденных тканях были проведены в опытах на лабораторных животных.

2.1. Оценка регенеративной способности клеточного имплантата на модели кожной раны у крыс.

Модель кожной раны получают следующим образом: с кожи на спине крысы в месте предполагаемого разреза удаляют шерсть (круг диаметром 6-7 см), и операционное поле обрабатывают антисептическим 2%-м раствором йода и 70%-ым этиловым спиртом. Далее хирургическим методом вырезают круглый участок кожи диаметром 3 см. Во избежание стягивания кожи, к краям раны изнутри подшивают стерильное кольцо диаметром 3,5 см, сделанное из поливинхлорида. После чего сверху рану накрывают толстым слоем стерильной марли, пропитанной антисептическим раствором, и фиксировали ее к коже клеем БФ-6, во избежание механического удаления повязки. Животных помещают в отдельные клетки.

Через 3 дня, животным под наркозом на поверхность раны наносят исследуемый клеточный имплантат. После чего опять накладывают защитную повязку. Через 10 дней крыс выводят из эксперимента, вырезают раны вместе с подлежащими тканями, фиксируют в течение ночи в растворе нейтрального 10% формалина и делают гистологические срезы по стандартной методике. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. Количество регенерирующихся аксонов подсчитывают с использованием электронной микроскопии.

Результаты испытаний показали, что при трансплантации клеточного имплантата под действием коллагеновой структуры имплантата с фибробластами происходит стимуляция контракции соединительной ткани и синтеза коллагена. Аллогенные фибробласты и кератиноциты продуцируют цитокины, в том числе интерлейкины, факторы роста фибронектин, коллаген IV типа, ламинин, тромбопластин и другие вещества, суммарный эффект действия которых выражается в стимуляции процессов регенерации поврежденных тканей. Нейральные клетки из ретинального пигментного эпителия глаза создают условия для регенерации нервных волокон. Аллогенные кератиноциты также создают условия для краевой эпителизации за счет формирования базальной мембраны. В дальнейшем аллогенный эпителий замещается гистотипическим.

2.2. Оценка регенеративной способности клеточного имплантата в тестах «открытое поле» и «условный рефлекс двустороннего избегания».

В сравнительных испытаниях на лабораторных животных исследуют заявленный клеточный имплантат, содержащий клетки ретинального пигментного эпителия глаза, и известный аналог - универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, содержащий эмбриональные клетки мозга. Для этого имплантаты трансплантируют трем группам животных (две группы опытные и одна контрольная). Оценку влияния исследуемых имплантатов на регенерацию нервной ткани проводят в поведенческих тестах и морфологическими методами.

В поведенческих тестах «открытое поле» и «условный рефлекс двустороннего избегания» оценивают функциональное состояние нервной системы животных после трансплантации. Результаты испытаний показали, что животные в группе с трансплантированными клетками ретинального пигментного эпителия глаза обучаются лучше, чем в группе с трансплантацией клеток мозга.

Количественный морфологический анализ показал, меньше всего нормальных и больше всего отечных нейронов в опытной группе, которой трансплантировали известный аналог. Наиболее сохраненные нейроны в группе с трансплантированными клетками ретинального пигментного эпителия глаза, где выявлено наибольшее число нормальных и наименьшее количество сморщенных клеток.

Таким образом, в экспериментах in vitro было показано, что применение предлагаемого клеточного имплантата для восстановления дефектов и иннервации в тканях и органах позволит повысить эффективность лечения благодаря комплексному воздействию на зону повреждения с восстановлением в них структурной целостности, иннервации и функций.

1. Клеточный имплантат для закрытия дефектов и восстановления иннервации в тканях и органах, выполненный в виде объемной трехмерной тканеинженерной конструкции, включающий аллогенные клетки мезенхимы, клетки эпителия и матрицу-носитель, основа которой выполнена из многокомпонентной коллагеновой структуры, внутри которой расположен, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в форме сетки, при этом клетки мезенхимы расположены внутри матрицы-носителя, а клетки эпителия нанесены на ее поверхность, отличающийся тем, что в коллагеновую структуру матрицы-носителя дополнительно включены нейральные прогениторные клетки, выделенные из ретинального пигментного эпителия глаза.

2. Имплантат по п.1, где коллагеновая структура выполнена в виде геля, губки или сетчатой формы.

3. Имплантат по п.1, где коллагеновая структура содержит компоненты, необходимые для поддержания и роста клеток.

4. Имплантат по п.1, где клетками мезенхимы являются фибробласты человека, выделенные из донорского материала.

5. Имплантат по п.1, где клетками эпителия являются кератиноциты, выделенные из биоптатов кожи реципиента, или донора после пластических операций, или их смесь.