Тест-система для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина

Авторы патента:

C12Q1 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

(57) Реферат

Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно биотехнологии диагностических тест-систем, предназначенных для скрининга веществ с биологической активностью. Предложенная тест-система предназначена для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина и включает в себя стандартный 96-луночный планшет с крышкой, упакованный в полимерный пакет. Чувствительная среда, распределенная в лунках, представляет собой иммобилизованную суспензию красных дрожжей. В результате достигается малый расход компонентов и большой срок годности тест-системы.

Из а.с. СССР 443902 SU известен способ получения фермента, иммобилизованного в полимеризационном геле. Причем активность фермента не падала.

Наиболее близким аналогом является тест-система для иммунологического анализа по методике ELISA ["ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects", Editors D.M.Kemeny & S.J.Challacombe, John Wiley, 1988], в соответствии с которой реагент связывается (иммобилизуется) нерастворимой поверхностью-носителем, например, дном лунки.

Целью полезной модели является уменьшение времени анализа при сохранении значительного срока хранения.

Цель достигается за счет того, что тест-система для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина представляет собой суспензию красных дрожжей в среде, содержащей от 0,1 % до 10 % глюкозы и от 5 мМ до 200 мМ фосфатного буфера рН 6,8, иммобилизованных в полиакриламидный гель, которая распределена в лунках стандартного 96-луночного планшета с крышкой. За счет иммобилизации дрожжей достигается высокая чувствительность препарата и, следовательно, малый расход компонентов. За счет того, что используют суспензию дрожжей, достигается значительный срок годности тест-системы, так как грибы иммобилизованы вместе с питательной средой.

Описание рисунков

На рисунке 1 представлено схематическое изображение лунки планшета тест-системы для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина. 1 - лунка планшета, 2 - исследуемое вещество, 3 - чувствительная среда, представляющая собой полиакриламидный гель с иммобилизованными клетками дрожжей.

Осуществление полезной модели

Тест-система для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина включает в себя стандартный 96-луночный планшет с крышкой, упакованный в полимерный пакет, а также суспензию красных дрожжей, например, рода Rhodotorula, иммобилизованных в полиакриламидный гель. Для приготовления суспензии красные дрожжи инкубируют в среду, содержащую (г/л): глюкоза 20; пептон 20; дрожжевой экстракт 10, NaCl 1,0 рН 6,5. Дрожжи инкубируют при 30°С 16 ч со встряхиванием 120 rрm. Клетки отделяют центрифугированием и суспендируют в среде до плотности 0,6 (А530). Для изготовления тест-системы использовали стандартный планшет с крышкой с плоским дном и объемом лунки 250 мкл, который активируют 20 минут путем облучения УФ. В лунку вносят от 10 мкл до 100 мкл 8% ПААГ и от 10 мкл до 100 мкл суспензии дрожжей в среде, содержащей от 0,1 % до 10 % глюкозы и от 5 мМ до 200 мМ фосфатного буфера рН 6,8. Плашки накрывают крышкой и помещают в термостат при температуре от 20°С до 45°С на 2 ч для иммобилизации клеток в ПААГ. Далее тест-систему упаковывают в полимерный пакет. Срок годности тест-системы составляет 2 месяца при хранении при 8°С.

Результат основан на том, что пигментообразование у красных дрожжей является адаптивным признаком, защищающим клетки от УФ. Изменение пигментации дрожжей сопровождается нарушением синтеза сквалена. Данную зависимость можно использовать как простой диагностический маркер для предварительного скрининга лекарственных препаратов, влияющих на уровень сквалена на пути от синтеза 3-гидрокси-3-метилглютарил-КоА. Корреляция между пигментообразованием и подавлением эпоксидирования сквалена позволяют предложить тест систему для первичного скрининга биосинтеза холестерина, основанную на визуальном контроле. Для анализа действия ингибиторов биосинтеза холестерина дрожжи инкубировали 3суток при 37°С в реакционных смесях объемом 200 мкл до появления результата.

Изменение окраски до желтой и белой свидетельствует об активности вещества, как ингибитора активности биосинтеза холестерина.

Тест-система для скрининга ингибиторов биосинтеза холестерина, включающая планшет с лунками и чувствительную среду, распределенную в лунках, отличающаяся тем, что чувствительная среда представляет собой суспензию красных дрожжей в среде, содержащей от 0,1% до 10% глюкозы и от 5 мМ до 200 мМ фосфатного буфера рН 6,8, иммобилизованных в полиакриламидный гель.