Комбинированная иммунохроматографическая тест-система для определения белков-маркеров инфаркта миокарда сбсжк и тропонина i в цельной крови
Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического выявления белков-маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови и, может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении. Техническим результатом полезной модели является создание более простой в изготовлении и более понятной для интерпретации комбинированной иммунохроматографической экспресс тест-системы для одновременного быстрого определения сБСЖК и тропонина I. Тест-система содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости. На подушке (5) сформирована зона, содержащая конъюгат частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I. На пористой мембране (7) сформированы последовательно тестовая зона, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I и контрольная поперечная полоса (9), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Тест система содержит поперечную конкурирующую полосу (10), содержащую слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты. Зона, сформированная на подушке (5) выполнена в виде одной поперечной полосы (11), а конъюгат частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана указанная полоса (11); поперечная конкурирующая полоса (10), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку расположена на фильтрационной подушке (6); тестовая зона, сформированная на хроматографической мембране (7), выполнена в виде одной поперечной тестовой полосы (12), а адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана тестовая полоса (12). 7 п.ф., 2 табл. и 2 ил.
Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического одновременного выявления сердечного белка, связывающего жирные кислоты и белка тропонин I в цельной венозной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и, может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении.
Сердечный БСЖК - кардиоспецифический цитоплазматический низкомолекулярный белок (15 кДа), в большом количестве содержащийся в кардиомиоцитах, осуществляет связывание и транспортировку жирных кислот внутри клетки и при некрозе миокарда быстро попадает в кровоток. Достоинством сБСЖК является высокая кардиоспецифичность вследствие максимальной концентрации сБСЖК именно в ткани миокарда. Сердечный БСЖК является ранним маркером некроза миокарда, он обладает сходной с миоглобином кинетикой, однако имеет большую специфичность. Диагностически значимое повышение уровня сБСЖК наблюдается через 1 час от начала болевого синдрома. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч. Количество сБСЖК в крови увеличивается пропорционально обширности и глубине зоны инфаркта, и достигает уровня более 200-300 нг/мл при верхней границе нормы 15 нг/мл. Таким образом, кардиомаркер сБСЖК является наиболее ранним из всех маркеров некроза миокарда, что особенно актуально учитывая стремительность событий, развивающихся при ОКС и высокий уровень неблагоприятных исходов именно первые его сутки. Тест-система по определению сБСЖК оказывает существенную помощь в диагностике ОКС, особенно в ситуациях с нетипичной клинической картиной и отсутствием значимых диагностических изменений электрокардиограммы. Кроме того, повышение уровня сБСЖК является предиктором неблагоприятный событий у больных с ОКС (инфаркт миокарда и сердечно-сосудистая смерть) в течение 1 года. Определение содержания сБСЖК в крови больных с подозрением на ОКС с целью раннего выявления некроза миокарда рекомендовано решением ежегодного конгресса Европейского кардиологического общества в 2000 г.
Тропонин 1 - белок, входящий в тропониновый комплекс, различие изоформ которого в миокарде и скелетных мышцах составляет около 90%. Благодаря этому, сердечный тропонин - 1 (сТн-1) является высокочувствительным и высокоспецифичным маркером повреждения миокарда. В норме тропонин I в кровотоке не обнаруживаются. При ишемическом повреждении миокарда тропонины поступают в периферический кровоток, где могут определяться через 6-8 часов. Максимальная концентрация отмечается через 14-28 часов и сохраняется в течение 3-7 суток, образуя длительное «диагностическое окно». Процесс освобождения тропонина I имеет однофазный характер, что обусловлено большим содержанием его цитоплазменной фракции. Если растворенный в цитозоле сБСЖК относительно быстро вымывается из зоны некроза, деструкция сократительного аппарата кардиомиоцитов более продолжительна по времени, поэтому увеличение уровня тропонинов определяется до 3-7 дней после начала ИМ. Этот длительный период выхода тропонинов в кровь увеличивает вероятность того, что положительный результат его определения был правильным, особенно в подострой фазе ИМ. Специфичность и чувствительность методов определения тропонинов в крови при ИМ составляет 92-95%.
Известен комбинированный тест-микрочип для диагностики восьми сердечнососудистых заболеваний (Патент Китая 
2783324, МПК G01N 33/543, опубл. 24.05.2006 г.) и содержит антитела типа anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnI (сердечный troponin I), anti-cTnT (сердечный troponin Т), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-h-fabp (сердечный белок связывающий жирные кислоты), anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB).
Однако такой тест является сложным в изготовлении и дорогостоящим изделием, требует специального оборудования для прочтения результатов, что не обеспечивает требованиям «прикроватной» экспресс-диагностики.
Известна тест-система для иммунохроматографического одновременного определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в образце крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, разработанная китайской компанией LANZHOU INST OF BIOLOG PRODUCTS (CN, 101806804, МПК G01N 33/551, опубл. 18.08.2010). Кроме того, известен комбинированный тест БСЖК - Тропонин I (CardioDetect Combi), разработанный германской фирмой Rennesens GmbH, конструкция которого опубликована в международной заявке (WO, 03044531, МПК G01N 33/543, опубл. 30.05.2003 г.).
Наиболее близким аналогом (прототипом) является тест-система «Кардиотест» для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (Евразийский патент 013943. МПК G01N 33/68, опубл. 30.08.2010 г.). Тест-система содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (16A11), на пористой мембране, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител (F9), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (19C7) и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Однако, такой тест часто оказывается сложным в интерпретации из-за присутствия сразу двух тестовых полос. Кроме того, чем больше наносят полос на подушке конъюгата и пористой мембране, тем более сложным и более дорогостоящим становится тест в изготовлении, требуя дополнительных операций и/или более сложного оборудования по его изготовлению.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является создание более простой в изготовлении и более понятной для интерпретации аналитической иммунохроматографической комбинированной тест-системы для одноэтапного определения белков маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови.
Указанный технический результат достигается тем, что в комбинированной иммунохроматографической тест-системе для определения белков-маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови, содержащей иммунологическую планшету с окном для внесения исследуемого образца крови и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке для образца и конъюгатов сформирована зона, содержащая конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (F9) моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (I-60) мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на пористой хроматографической мембране сформированы последовательно тестовая зона, содержащая адсорбированные вторые (F10) моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые (IC-19) моноклональные антитела к тропонину I и контрольная поперечная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM), кроме того, тест система содержит поперечную конкурирующую полосу, содержащую слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, согласно полезной модели, зона, сформированная на подушке конъюгатов выполнена в виде одной поперечной полосы, а конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (F9) моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (I-60) мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана полоса на подушке конъюгатов; поперечная конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку (сБСЖК) расположена на фильтрационной подушке; тестовая зона, сформированная на хроматографической мембране, выполнена в виде одной поперечной тестовой полосы, а адсорбированные вторые (F10) моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые (IC-19) моноклональные антитела к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана тестовая полоса.
Полоса на подушке с конъюгатами и полосы на пористой хроматографической мембране сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.
Подушка для нанесения конъюгатов выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см2.
Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см2 . Пористая хроматографическая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2, скоростью течения 90-110 сек/40 мм. Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.
Указанные технические характеристики элементов тест-системы позволяют надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста и одновременно определять сБСЖК и тропонина I.
Полезная модель поясняется следующими графическими материалами. На фиг.1 приведена схема внешнего вида тест системы, выполненной в виде иммунологической планшеты. На фиг.2 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете.
Комбинированная иммунохроматографическая тест-система для определения белков-маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови, содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов. Внутри планшеты (1) размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости. На подушке (5) с клнъюгатами сформирована зона, содержащая конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (F9) моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (I-60) мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I. На пористой мембране (7) сформированы последовательно тестовая зона, содержащая адсорбированные вторые (F10) моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые (IC-19) моноклональные антитела к тропонину I и контрольная поперечная полоса (9), содержащая адсорбированные моноспецифичные полиютональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Кроме того, тест система содержит поперечную конкурирующую полосу (10), содержащую слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и расположенную на фильтрационной подушке (6). Зона, сформированная на подушке (5) с конъюгатами выполнена в виде одной поперечной полосы (11), а конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (F9) моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми (I-60) мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана указанная полоса (11). Тестовая зона, сформированная на хроматографической мембране (7), выполнена в виде одной поперечной тестовой полосы (12), а адсорбированные вторые (F10) моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и адсорбированные вторые (IC-19) моноклональные антитела к тропонину I представляют собой смесь указанных компонентов, которой пропитана тестовая полоса (12).
Кроме того, имеется участок (13) для нанесения образца цельной крови на подложке (5), расположенный перед полосой (11) конъюгатов частиц коллоидного золота с моноклональными антителами. Причем, овальное окно 2 планшеты 1 расположено над участком 13 на подложке 5.
Полоса (11) на подушке (5) с конъюгатами, полоса (10) на фильтрационной подушке (6) и полосы (9 и 12) на пористой мембране (7) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. Подушка (5) с конъюгатами выполнена из целлюлозы или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см2. Фильтрационная подушка (6) выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см2. Пористая хроматографическая мембрана (7) выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2, скоростью течения 90-110 сек/40 мм. Абсорбционная подушка (8) выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. Подложка (4) для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.
Конструкция иммунологической планшеты (1) обеспечивает контакт подушек (5 и 6), пористой хроматографической мембраны (7) и абсорбционной подушки (8) друг с другом и позволяет образцу крови, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.
На конъюгатной подушке (5) на линии (11) содержание конъюгатов моноклональных антител с частицами коллоидного золота составляет 0,02-0,2 единиц оптической плотности (ОП ед). На фильтрационной подушке (6) конкурирующая полоса (10) содержит 0,3-1,0 мкг моноклональных антител; тестовая полоса (12) содержит 1,0-8,0 мкг моноклональных антител; а контрольная полоса (9) содержит поликлональные антитела в количестве 0,3-2,0 мкг.
| Таблица 1. | ||
| Характеристика материалов тест-системы | ||
| Наименование элемента тест-системы | Состав материалов | Характеристики материалов |
| Подложка 4 для ламинирования | белый полистирол или акриловый адгезивный материал. | - толщина подложки 254 мкм +/-10%; |
| Подушка 5 с конъюгатами для нанесения образца крови | целлюлоза или стеклянное микроволокно; или полиэфирное микроволокно; | - размер пор 20-25 мкм; |
| - абсорбционная емкость 55 мг/см2; | ||
| - высвобождение конъюгата (спустя 90 сек) 89%; | ||
| - толщиной 350 мкм; | ||
| Фильтрационная подушка 6 | пористый материал из полисульфона | - толщиной 600-650 мкм;- объем пор 56,8 мкл/см2 ; |
| Пористая мембрана 7 | нитроцеллюлоза или полиэфирсуль-фон, или нейлон, или поливинилиденхлорид на полистирольной подложке | толщина мембраны 125-155 мкм |
| - толщина подложки 100 мкм; абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2, | ||
| - скорость потока образца 90-110 сек/40 мм; | ||
| Абсорбционная подушка 8 | пористый материал из хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозное волокно | - толщина 429 мкм; - сухой вес 12,4 мг/см2; |
Ниже приведена характеристика антител, используемых в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови.
1. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку сБСЖК (FABP).
1.1. Моноклон F9, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 - применяется в полосе (5) (конъюгирован с коллоидными частицами золота) и конкурирующей полосе (10).
1.2. Моноклон F10, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 - наносится на конкурирующую полосу (10) и тестовую полосу (12).
2. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку тропонина I
2.1. Моноклон 1-60 специфичен к целой молекуле сердечного TnI, тип IgG1 - применяется в полосе (5) (конъюгирован с коллоидными частицами золота).
2.2. Моноклон IC-19 специфичен к целой молекуле сердечного TnI, тип IgG2b - наносится на тестовую полосу (12).
3. Моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Аффинно-очищенная фракция иммуноглобулинов кроличьей антисыворотки против Fc-фрагментов иммуноглобулинов мыши. Применяется для связывания конъюгатов мышиных моноклональных антител на контрольной полосе (9).
Заявляемая комбинированная тест-система работает следующим образом. Кровь в объеме 50-150 мкл (2-6 капель) наносится через приемное окно 2 на подушку (5) с конъюгатами. Образец крови, пройдя через подушку (5), под действием капиллярных сил пропитывает полосу (11), где присутствующие в крови белки-маркеры (сБСЖК и/или тропонин I) вступают в реакцию с соответствующими белку моноклональнми антителами, меченными коллоидным золотом, образуя окрашенные иммунные комплексы антиген-антитело. Далее иммунные комплексы впитываются фильтрационной подушкой (6), где происходит сепарация крови (отделение эритрацитарной массы). При определении тропонина I требуется высокая чувствительность тест-системы - 1 нг/мл и выявление как цельной молекулы, так различных ее фрагментов. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество колеблется от 0,5 до 1 нг/мл выявляемого агента. В предлагаемой конструкции комплексы антиген + антитело, меченное частицами коллоидного золота, начинают формироваться сразу на конъюгатной подушке (5) и продолжают формироваться по мере прохождения через фильтрационную подушку (6) и пористую хроматографическую мембрану (7), тем самым, обеспечивается достаточное время для этого контакта и снижается вероятность гидролиза лабильных молекул белка тропонина I. Образовавшиеся окрашенные иммунные комплекы движутся под действием капиллярных сил вдоль фильтрационной подушки (6), пересекают конкурирующую полосу (10), где сБСЖК взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными первыми или вторыми моноклональными мышиными антителами F9 или F10, специфичными к сБСЖК. Функция полосы (10) является снижение аналитической чувствительности части теста, ответственной за выявление сБСЖК до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на этой полосе 10. Указанная полоса не окрашивается поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови от 15 нг/мл. Уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности.
Под действием капиллярных сил связанные иммунные комплексы не распадаются и не оседают на них вместе с эритроцитами, свободно проходят с потоком плазмы на пористую хроматографическую мембрану (7) и движутся вдоль последней. При этом иммунные комплексы пересекают тестовую полосу (12) и взаимодействуют с иммобилизованными на ней вторыми моноклональными мышиными антителами F10 к сБСЖК и вторыми моноклональными мышиными антителами IC-19 к TnI. В результате при наличии сБСЖК и/или TnI в образце крови выше порогового значения тестовая полоса (12) окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит ни сБСЖК ни TnI в концентрациях выше пороговых значений, то тестовая полоса (12) остается не окрашенной. Далее не связавшиеся на тестовой полосе (12) иммунные комплексы движутся вдоль пористой мембраны (7), доходят до контрольной полосы (9) и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими поликлональными антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная полоса (9) также окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Контрольная полоса (9) является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК и тропонина I в образце крови.
Результаты определяются визуально в течение 5-30 минут. При положительном результате тестирования сБСЖК и/или тропонина I появляются две окрашенные полосы - тестовая и контрольная. Интенсивность окрашивания контрольной и тестовой полос может быть различной. При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными.
Ниже приведены данные исследований, подтверждающие технический результат, достигаемый заявляемой тест-системой.
Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 7 нг/мл. Диагностический уровень (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 12 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявление маркера. При использовании теста для экспресс-диагностики высокая чувствительность не всегда необходима, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Конкурирующая полоса (10) обеспечивает снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания БСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на этой полосе (10). Поскольку диагностическим значимым считается уровкнь сБСЖК в крови от 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности теста при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Действительно, применение конкурирующей полосы (10) позволяет значительно уменьшить количество ложноположительных результатов, при этом, не увеличивая количество ложноотрицательных и, таким образом, при сохранении прежнего уровня диагностической чувствительности увеличивается специфичность и, как следствие, точность теста.
Тест система для определения Тропонина I, требует высокой чувствительности до 1 нг/мл. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество от 0,5 нг/мл выявляемого агента. Заявляемая тест-система позволяет выявлять наличие тропонина I в крови в концентрациях от 1 нг/мл.
Одновременное определение в заявляемой тест-системе специфичного сБСЖК и тропонина I позволяет обеспечить надежный и быстрый диагноз и увеличить временной интервал диагностики до 72 часов. Комбинация этих маркеров позволяет избежать недостатков тестов, содержащих только один из указанных маркеров. В таблице 2 приведены данные диагностических показателей заявляемой тест-системы в сравнении с выпускаемыми тест-системами для выявления сердечного белка, связывающего жирные кислоты сБСЖК («КардиоБСЖК»), производства ООО НПО «БиоТест», Россия и для выявления тропонина I («Troponin I WB Test»), производства «VEDA.LAB
» («ВЕДАЛАБ»), Франция
| Таблица 2. | ||||
| Сравнительные данные диагностических показателей заявляемой тест-системы и выпускаемыми тест-системами (аналогами) | ||||
| Заявляемый комбинир. тест |  | |||
| Время, (ч) | Пациенты, (количество) | Чувствительность, (%) | Специфичность, (%) | Точность, (%) |
| 2 | 37 | 85,2 | 90,0 | 86,5 |
| 6 | 40 | 100,0 | 100,0 | 100,0 |
| 12 | 40 | 100,0 | 90,9 | 97,5 |
| 24 | 40 | 100,0 | 90,9 | 97,5 |
| 72 | 40 | 72,4 | 90,9 | 77,5 |
| Сумма | 197 | 91,6 | 92,6 | 91,9 |
| КардиоБСЖК | | |||
| Время, (ч) | Пациенты, (количество) | Чувствительность, (%) | Специфичность, (%) | Точность, (%) |
| 2 | 37 | 85,2 | 90,0 | 86,5 |
| 6 | 40 | 100,0 | 100,0 | 100,0 |
| 12 | 40 | 100,0 | 90,9 | 97,5 |
| 24 | 40 | 86,2 | 90,9 | 87,5 |
| 72 | 40 | 6,9 | 100,0 | 32,5 |
| Сумма | 197 | 75,5 | 94,4 | 80,7 |
| Troponin I WB Test | | |||
| Время, (ч) | Пациенты, (количество) | Чувствительность, (%) | Специфичность, (%) | Точность, (%) |
| 2 | 37 | 11,1 | 100,0 | 35,1 |
| 6 | 40 | 62,1 | 100,0 | 72,5 |
| 12 | 40 | 96,6 | 100,0 | 97,5 |
| 24 | 40 | 93,1 | 100,0 | 95,0 |
| 72 | 40 | 64,3 | 91,7 | 72,5 |
| Сумма | 197 | 66,2 | 98,2 | 75,1 |
Диагностические показатели рассчитывались по формулам:
Чувствительность -
TPR=TP/(TP+FN);
Специфичность -
SPC=TN/ (FP+TN);
Точность -
ACC=(TP+TN)/N,
где ТР достоверно положительный результат,
FN достоверно отрицательный результат,
FP ложноположительный результат
FN ложно отрицательный результат
N количество всех пациентов.
Из таблицы 2 видно, что по сравниваемым показателям (чувствительность, специфичность и точность) заявляемая комбинированная тест-система не уступает коммерческим, обеспечивающим определение одного кардиомаркера.
Применение теста позволит врачу при отсутствии у пациента четко выраженной клинической картины инфаркта миокарда и отсутствии четких признаков в кардиограмме, независимо от временного интервала от начала болевого синдрома, принять решение о срочной госпитализации больного. По тем же причинам необходимо иметь комбинированные тесты для диагностики инфаркта миокарда в фельшерско-акушерских пунктах. Положительный результат анализа позволит обоснованно вызвать скорую помощь или бригаду санавиации из ближайшего места ее нахождения. Простота в использовании и интерпретации результатов, а так же малые размеры и вес иммунохроматографических тестов позволяют использовать их участковым врачом или врачом общей практики при посещении больного на дому.
По сравнению с наиболее близкой тест-системой (прототипом) заявляемая аналитическая иммунохроматографическая комбинированная тест-система является более простой в изготовлении и более понятной для интерпретации при определении белков-маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови, что подтверждает заявляемый технический результат.
1. Комбинированная иммунохроматографическая тест-система для определения белков-маркеров инфаркта миокарда сБСЖК и тропонина I в цельной крови, содержащая иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (5) с конъюгатами сформирована зона, содержащая конъюгат частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на пористой мембране (7) сформированы последовательно тестовая зона, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I, и контрольная поперечная полоса (9), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM), кроме того, тест система содержит поперечную конкурирующую полосу (10), содержащую слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, отличающаяся тем, что зона, сформированная на подушке (5) с конъюгатами, выполнена в виде одной поперечной полосы (11), а конъюгат частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и конъюгат частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, представляют собой смесь, которой пропитана указанная полоса (11); поперечная конкурирующая полоса (10), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, расположена на фильтрационной подушке (6); тестовая зона, сформированная на хроматографической мембране (7), выполнена в виде одной поперечной тестовой полосы (12), а адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I представляют собой смесь, которой пропитана тестовая полоса (12).
2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что полоса (11) на подушке (5) с конъюгатами, полоса (10) на фильтрационной подушке (6) и полосы (9 и 12) на пористой мембране (7) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.
3. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что подушка (5) с конъюгатами выполнена из целлюлозы, или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см2.
4. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что фильтрационная подушка (6) выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см2.
5. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что пористая хроматографическая мембрана (7) выполнена из нитроцеллюлозы или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2, скоростью течения 90-110 с/40 мм.
6. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что абсорбционная подушка (8) выполнена из пористого материала хлопкового пуха или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм.
7. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что подложка (4) для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.
