Устройство для одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов

 

Полезная модель относится к биотехнологии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине и касается устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов. Составными частями устройства являются установленная на вращающуюся платформу совокупность сменных модулей, каждый из которых содержит все реагенты, необходимые для обработки биологического образца, электродвигатель, компрессор, блок воздушных клапанов, блок формирования воздушных потоков, блок распределения воздушных потоков, нагреватель, блок перемешивания смесей, блоки питания, блок электронного управления, корпус с крышкой и запорным механизмом. В каждом из модулей происходит выделение и очистка нуклеиновых кислот из одного биологического образца. Перемещение реакционных смесей внутри модулей осуществляется при вращении платформы, а также при подаче избыточного давления в соответствующие резервуары модулей через систему клапанов. Подача избыточного давления осуществляется компрессором через блок формирования и блок распределения воздушных потоков. Процедура обработки образцов осуществляется внутри модулей, изолированных от внешней среды, что сводит к минимуму риск контаминации и заражения персонала. Полученные очищенные препараты нуклеиновых кислот можно непосредственно использовать для проведения гибридизации, амплификации и/или последующих молекулярно-генетических анализов.

Полезная модель относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, микробиологии и медицине и касается устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот (НК) из нескольких биологических образцов. Устройство осуществляет все стадии обработки биологических образцов (крови, слюны, культуральных жидкостей, содержащих клетки, микроорганизмы и/или вирусные частицы) в автоматическом режиме внутри сменных одноразовых модулей, изолированных от внешней среды. Использование устройства значительно упрощает процедуру выделения НК для персонала, снижает риск заражения при работе с патогенными образцами, уменьшает вероятность кросс-контаминации исследуемых образцов, позволяет во много раз увеличить количество проводимых лабораторией анализов и сократить трудозатраты. Полученные очищенные НК можно использовать для проведения ПЦР и молекулярно-генетических анализов.

Анализ нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) является основой большинства методов современной молекулярной диагностики. Количество анализов на основе НК, проводимых как в клинических, так и в научно-исследовательских лабораториях, неуклонно возрастает. В настоящее время выделение и очистка НК из биологических образцов, включающих клинический материал, в лабораториях РФ, а также в большинстве зарубежных лабораторий проводится вручную и является наиболее трудоемкой стадией анализа. Следствием того, что отсутствует аппаратура, позволяющая автоматизировать процедуру выделения НК, является повышенная частота заболеваемости персонала, работающего с инфекционным биологическим материалом.

Выделение НК из клинических образцов в автоматическом режиме проводится при диагностике инфекционных заболеваний, таких как, например, туберкулез, включая лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, гепатиты, выявлении инфекций, передаваемых половым путем, дифференциальной диагностике возбудителей неонатальных и внутриутробных инфекций, при анализах для определения личности по последовательностям ДНК и тестах на наличие мутаций и полиморфизмов генома человека для определения индивидуальных предрасположенностей к ряду заболеваний и переносимости некоторых лекарств. Таким образом, имеется острая потребность в автоматизированных устройствах для выделения и очистки НК, соответствующих современным требованиям, включающим универсальность протокола обработки образцов различного типа, возможность одновременной обработки нескольких проб, высокое качество и количественный выход получаемых препаратов НК, безопасность выполнения процедуры.

В настоящее время существует ряд устройств, осуществляющих полностью или частично автоматизированное выделение НК, и в некоторых из них происходит одновременная обработка нескольких биологических образцов. В большинстве таких устройств используется принцип сорбции НК на твердофазных сорбентах, к которым относятся ионообменные смолы, кварцевые и стеклянные частицы и волокна, диатомит, цеолиты, пористые монолитные матрицы на основе кремния и различных полимеров и др. (Wolfe К.А., Breadmore М.С., Ferrance J.P., Power M.E., Conroy J.F., Norris P.M., Landers J.P. Toward a microchip-based solid-phase extraction method for isolation of nucleic acids, Electrophoresis, 2002, v. 23, p.727-733; Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present, J. Biomed. Biotechnol., 2009, 74398).

Патент США компании Fujifilm Corporation (Япония) 7,682,818 (Apparatus for separating and purifying nucleic acid and method for separating and purifying nucleic acid) посвящен устройству для выделения и очистки НК в виде шприца цилиндрической формы, состоящего из нескольких сосудов, соединенных с резервуарами, в которые помещены фильтры и твердофазные сорбенты различного типа. Биологический образец, растворы для промывки образца после сорбции на твердофазном носителе и растворы для десорбции ДНК прокачиваются через шприц под давлением с помощью микронасосов через систему клапанов, которые открываются при разных давлениях. Перед введением образца в устройство необходима предварительная обработка биологического образца: проведение лизиса клеток.

Подана заявка на патент (Nucleic acid isolation, заявка WO/2005/012521, фирма Invitrogen Corp., США), касающийся картриджа для выделения НК, состоящего из пробирки, соединенной с фильтрующим элементом, содержащим несколько слоев, и далее с колонкой, включающей носитель, способный связывать НК, например носитель с переменным зарядом. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса. В этом случае также необходима предварительная обработки образца перед введением его в картридж: проведение лизиса.

Имеется патент на устройство для выделения НК из клеток, вирусных частиц и микоплазмы (Filter device for the isolation of a nucleic acid, патент ЕР 1873242 A2, фирма Millipore Corporation (США)), состоящее из системы фильтрующих элементов (пористых мембран), через которые последовательно пропускается образец. На первой мембране, изготовленной из полисахарида или полиэфирсульфона, выполняется лизис клеток, и далее лизат поступает на стекловолоконный фильтр для последующей очистки и элюции НК. Перемещение жидкостей внутри устройства осуществляется с использованием системы клапанов. Устройство может быть как одноразового, так и многоразового использования. Для одновременной обработки нескольких образцов несколько фильтрующих устройств могут быть собраны в кассету. Использование системы мембран и клапанов неизбежно приводит к потерям НК, и выход очищенных НК недостаточно высок.

Патентная заявка WO/2010/025302 (Apparatus for and method of processing biological samples, Life Technologies Corp., США) описывает аппарат для автоматизированной обработки биологических образцов, в котором осуществляется иммунопреципитация, выделение рекомбинантных белков и выделение и очистка НК. Очистка НК происходит на твердых носителях, таких как мембраны и колонки с ионообменными смолами. В аппарат помещаются сменные картриджи, которые соединяются с контейнерами, содержащие необходимые реагенты. Движение жидкого образца управляется сложной системой насосов и клапанов.

Фирмой Cepheid, США, запатентовано устройство (картридж) для выделения и очистки НК из клеток, спор и микроорганизмов (Method for separating analyte from a sample, патент США 7,569,346). Картридж содержит камеру, в которой происходит лизис и высвобождение НК, устройство для нагревания, резервуар с веществом, поглощающим воду, резервуары с растворами для промывки и элюирования НК. Лизис осуществляется на бумаге или мембране, пропитанной химическими реагентами для лизиса, одновременно происходит высушивание образца на мембране (бумаге) при нагревании. При промывке НК остаются связанными с мембраной в камере для лизиса и затем элюируются при пропускании через мембрану раствора для элюирования. В качестве мембран могут быть использованы бумажные фильтры, стекловолокно, полимеры и др.

В последние годы в устройствах и аппаратах для автоматизированного выделения НК наиболее популярным становится метод выделения НК с использованием магнитных частиц - магнитных микросфер, на поверхности которых иммобилизованы лиганды для связывания биологических молекул (Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids, Appl. Microbiol. Biotechnol, 2006, v. 73, p.495-504; Gijs M.A., Lacharme F., Lehmann U. Microfluidic applications of magnetic particles for biological analysis and catalysis, Chem. Rev., 2010, v. 110, p.1518-1563). Магнитные частицы с адсорбированными на них НК осаждаются и перемещаются под действием магнитного поля. Способ с использованием магнитных частиц позволяет упростить процедуру выделения НК и избежать использования органических растворителей, однако применение этого способа требует наличия сложной системы управляющих магнитов.

Фирмой Samsung Electronics (Корея) запатентовано устройство для выделения и очистки НК из образцов крови, слюны, мочи и др. с на микрочастицах на основе кварца, полимеров, металлов и др., покрытых ферромагнетиком, таким как Fe, Ni, Cr и их оксиды (патент США 7,429,470 Method for purification of nucleic acids by phase separation using laser and beads). Разрушение клеток и вирусов достигается при облучении лазером. Размер магнитных частиц составляет от 50 нм до 50 мкм. Очистка НК в данном устройстве происходит, в основном, от ингибиторов ПЦР.

Заявка на патент США 20100262303 «Instrument for cassette for sample preparation» касается устройства для обработки биологических образцов, включающего систему подачи реагентов с помощью насосов, нагрев реагентов и смесей, систему магнитов для перемещения магнитных частиц со связанными НК, а также систему детекции, например методом ПЦР.

Все большее распространение в мире получают миниатюрные устройства на основе микрофлюидных систем, которые содержат сеть микроканалов диаметром 100 мкм и менее, через которые пропускаются биологические образцы и растворы реагентов, резервуары, в которых проводится разделение компонентов, очистка, концентрирование и другие процедуры, а также перемешивающие устройства, микродозаторы, микронасосы, фильтры и др. (Yobas L., Cheow L.F., Tang К.С., Yong S.E., Ong E.K., Wong L., Teo W.C., Ji H., Rafeah S., Yu C. A self-contained fully-enclosed microfluidic cartridge for lab on a chip, Biomed. Microdevices, 2009, v. 11, p.1279-1288; Mark D., Haeberle S., Roth G., von Stetten F., Zengerle R., Microfluidic lab-on-a-chip platforms: requirements, characteristics and applications. Chem. Soc. Rev., 2010, v. 39, p.1153-1182). В литературе отмечаются как преимущества таких систем: миниатюризация и автоматизация анализов, возможность осуществления параллельного анализа нескольких образцов, так и недостатки: неуниверсальность (анализ образцов определенного типа, необходимость предварительной обработки), высокая стоимость и сложность изготовления.

В европейском патенте ЕР 2163305 (Device and process for rapid isolation of a compound in a sample) описано микрофлюидное устройство, состоящее из системы резервуаров, содержащих мембраны и электроды. Очистка НК происходит путем последовательного перемещения образца через мембраны, закрепленные между электродами. Сорбция и десорбция НК проводится при приложении электрического поля на соответствующие электроды.

Запатентован микрочип, в котором очистка ДНК происходит путем последовательного прохождения образца через серию хроматографических микроколонок, селективно сорбирующих примесные вещества, такие как белки, пептиды, липиды, лектины и др., а последняя колонка селективно связывает ДНК (DNA purification in a multi-stage, multi-phase microchip, заявка WO/2008/058204). Некоторые стадии выделения требуют ручного введения реагентов; выход очищенных НК недостаточно высок.

Описано микрофлюидное устройство (Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step, заявка WO/2005/068627, 3M Innovative Properties company, США), включающее резервуар для загрузки образца и камеры для обработки и перемешивания, соединенные каналами и клапанами. Образец после загрузки подвергается действию лизирующего раствора, переходит далее в камеру для обработки, где проходит несколько стадий концентрирования и разбавления, а также дополнительный лизис и удаление раствора, содержащего ингибиторы, которые мешают проведению ПЦР с полученной ДНК. В данном устройстве осуществляется лишь частичная очистка НК, в основном, очистка от ингибиторов ПЦР.

Предложено монолитное микрофлюидное устройство для экстракции ДНК и РНК (Nucleic acid purification chip, заявка WO/2005/066343, Сингапур), состоящее из субстрата на основе кремния, входных и выходных отверстий для введения и выведения образца крови, а также буферов для обработки образца в объеме нескольких микролитров, микромешалки, камеры для лизиса, камеры, содержащей ДНК-связывающий материал и системы клапанов. Данное устройство позволяет выделять НК только из образца определенного типа (кровь).

Фирмой Siemens (Германия) предложен плоский картридж (карта) для автоматического анализа ДНК или белков, содержащий систему микроканалов и микрополостей, формирующих емкости для содержащихся в них сухих реагентов (Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge, заявка WO/2006/042838). Сухие реагенты вносятся в открытые каналы, которые после этого заклеиваются пленкой. Картридж является одноразовым устройством. Образец помещают в готовый к анализу картридж, и результаты получают в автоматическом режиме при помещении картриджа в считывающее устройство.

Патент США 7,666,687 (Miniaturized fluid delivery and analysis system) посвящен объединению микрофлюидной системы перемещения жидкостей с системой для проведения биологических анализов различного типа, в частности, ДНК-анализов. Предлагаемое устройство состоит из трех слоев, причем верхний и нижний слои содержат реакционные камеры, капиллярные каналы, микронасосы и микроклапаны, а промежуточный слой, изготовленный из эластичного материала, соединяет микрофлюидные структуры и служит диафрагмой для клапанов и насосов. Система пассивных клапанов контролирует перемещение жидкостей (или газов) от нижнего слоя к верхнему и наоборот при использовании эластичной прокладки (диафрагмы).

В заявке на патент США 20100112667 «Microfluidic Biological Extraction Chip» описан микрофлюидный картридж для выделения НК, состоящий из системы камер, соединенных микроканалами, включающей камеру для лизиса с использованием электрического поля или химического лизиса, камеру для сорбции НК на твердофазном носителе. Сорбция осуществляется при взаимодействии с носителем «в кипящем слое». Картридж содержит реагенты для осуществления процедуры выделения.

Компанией NETBIO, Inc. (США) запатентовано устройство для очистки НК (заявка WO/2010/091080 «Nucleic acid purification»), содержащее макрофлюидный компонент, включающий камеру для подачи образца и резервуары, предварительно заполненные реагентами, и соединенный с ним микрофлюидный компонент, содержащий матрицу для очистки НК, а также приводной механизм, осуществляющий перемещение жидкостей.

В литературе описан ряд гораздо более сложных микрофлюидных аппаратов, в которых одновременно производится выделение ДНК и ее амплификация, а в ряде устройств и последующая детекция. Пример такой системы - устройство для выделения и амплификации ДНК из биологических жидкостей фирмы Micronics (США) (Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing, патентная заявка WO/2004/065010, патент США 7,416,892). Устройство представляет собой одноразовую микрофлюидную карту и предназначено для анализа бактерий в биологических жидкостях и диагностики некоторых заболеваний. Карта имеет встроенную фильтрующую мембрану, на которой задерживаются клетки, которые далее подвергаются лизису. Через мембрану последовательно пропускают серию растворов: растворы для отмывки, растворы, содержащие ферменты, растворы для амплификации и детекции. Проводится ПЦР-амплификация полученной ДНК, а далее ПЦР-продукт смывается с мембраны и передается на детектирующий элемент.

Компанией Microchip biotechnologies, США, запатентовано устройство, представляющее собой совокупность модулей, в первом из которых происходит связывание и очистка НК, а второй модуль является собственно микрофлюидным устройством, осуществляющим детекцию и анализ полученного продукта (Microfluidic devices, WO/2008/030631). Лизис клеток осуществляется обработкой ультразвуком в проточном режиме. Очистка ДНК осуществляется путем взаимодействия с магнитными частицами, содержащими аффинный носитель. Магнитное поле создается вращающимся магнитным блоком.

Фирмой Canon U.S. Life Sciences, США запатентовано устройство для анализа геномной ДНК, состоящее из картриджа, в котором проводится выделение ДНК, инжектора, с помощью которого ДНК передается на микрофлюидный чип, включающий зону для ПЦР-амплификации, зону для детекции и зону для анализа ДНК (Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic DNA, WO 2007028084; Methods and systems for microfluidic DNA sample preparation, WO/2010/009415 заявка на патент США 20100021910). Выделение ДНК происходит в реакционной камере с использованием магнитных частиц или материалов, меняющих свойства под действием электрического заряда.

Предложен полностью автоматизированный портативный микрофлюидный чип для обнаружения патогенных микроорганизмов методом ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time PCR detection of microorganisms using an integrated microfluidic platform, WO/2006/085948, Cornell Research Foundation, США). Микрочип включает модуль для лизиса и очистки ДНК, который с помощью микроканалов соединен с модулем для ПЦР-детекции. Детекция осуществляется методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного красителя.

Компанией CombiMatrix Corp., США, разработано миниатюрное микрофлюидное устройство, состоящее из ДНК-микрочипа, содержащего 12000 зондов, и микрофлюидного картриджа, имеющего в своем составе микро-насосы, мешалки, клапаны, микроканалы, микрорезервуары для реагентов. На чипе осуществляется электрохимический синтез олигонуклеотидных зондов. Перемешивание жидкостей в картридже осуществляется пропусканием микропузырьков, генерируемых электрохимическими микронасосами. Насосы также используются для перекачивания жидкостей внутри картриджа. После внесения образца проводится ПЦР и гибризизация на микрочипе. Устройство использовали для идентификации субтипов вируса гриппа A (Liu R.H., Lodes M.J., Nguyen Т., Siuda Т., Slota М., Fuji H.S., McShea A., Validation of a fully integrated microfluidic array device for influenza A subtype identification and sequencing, Anal. Chem., 2006, v. 78, p.4184-4193), а также для исследования экспрессии генов клеток лейкемии человека (Liu R.H., Nguyen Т., Schwarzkopf К., Fuji H.S., Petrova A., Siuda Т., Peyvan К., Bizak М., Danley D., McShea A. Fully integrated miniature device for automated gene expression DNA microarray processing, Anal. Chem., 2006, v. 78, p.1980-1986).

Фирмой Handylab, США, запатентован аппарат для экстрации НК и проведения диагностического тестирования множества биологических образцов методом ПЦР (Intergrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples, заявка WO 2009/054870, заявка на патент США 20090221059).

Устройство объединяет модули для выделения НК, включающие резервуары с растворами, штативы, магнитный сепаратор, нагреватель, диспенсеры жидкостей, и микрофлюидные модули для проведения ПЦР в реальном времени.

Разрабатываются также устройства для автоматизированного выделения и очистки НК, использующие перемещение растворов в резервуарах под действием центробежных сил. Движение жидкостей происходит под действием давления, вызванного вращением, и определяется частотой и направлением вращения (сила Кориолиса), геометрией каналов и расположением резервуаров на вращающемся диске. К основным преимуществам таких устройств относятся:

- упрощенная схема перемещения жидкостей за счет использования центробежных сил;

- высокая скорость перетекания растворов, которая практически не зависит от рН, ионной силы, химического состава жидкости;

- отсутствие необходимости использования высоких давлений для перемещения растворов внутри устройств;

- возможность миниатюризации;

- возможность одновременной обработки нескольких образцов. Перемещение растворов при центрифугировании используется в конструкциях микрофлюидиков, «лабораториях-на-чипе» и «лабораториях-на-CD-дисках» (Haeberle S., Zengerle R., Microfluidic platforms for lab-on-a-chip applications, Lab Chip, 2007, v. 7(9), p.1094-1110; Madou M., Zoval J., Jia G., Kido H., Kim J., Kim N., Lab on a CD, Annu. Rev. Biomed. Eng., 2006, v. 8, p.601-628). Разработкой таких систем занимается ряд компаний в Европе, США и Корее.

Фирмой Gamera Bioscience (США) предложено микрофлюидное устройство, в котором перетекание жидкости через микроканалы осуществляется при вращении платформы (Devices and methods for using centripetal acceleration to drive fluid movement in a microfluidics system with on-board informatics, EP 0865606 B1; Duffy D.C., Gillis H. L., Lin J., Sheppard N. F., Kellogg GJ. Microfabricated centrifugal microfluidic systems: characterization and multiple enzymatic assays, Anal. Chem., 1999, v. 71 (20), p.4669-4678). Устройство применяется для анализа образцов крови, например, определения уровня кислорода в крови, и одновременной детекции результатов ферментативных реакций (48 образцов).

Описана микрофлюидная система в форме компакт-диска, предназначенная для проведения лизиса клеток и гомогенизации микроколичеств биологического образца (объем образца до 70 мкл) (Kido Н., Micic М., Smith D., Zoval J., Norton J., Madou M., A novel, compact disk-like centrifugal microfluidics system for cell lysis and sample homogenization, Colloids Surf. B. Biointerfaces, 2007, v. 58 (1), p.44-51).

Микрофлюидные устройства в форме CD-диска разрабатываются фирмой Gyros (Швеция) (DNA isolation method, патент США 6,992,181; Integrated microfluidic disc, патент США 7,332,126; заявка WO/2001/047638). На диске располагается несколько микрофлюидных устройств: на одном проводится выделение НК из образца (например, из лизата клеток), в другом проводится амплификация выделенной ДНК, на третьем проводится очистка амплифицированного продукта. Устройство позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно.

Ряд патентов и патентных заявок по микрофлюидным платформам, в которых используются центробежные силы, принадлежит фирме Samsung Electronics (Корея): Magnetic bead-packing unit using centrifugal force, microfluidic device including the same, and immunoassay method using the microfluidic device, EP 1900432 A2; Cartridge containing reagent, microfluidic device including the cartridge, method of manufacturing the microfluidic device, and biochemical analysis method using the microfluidic device, заявка WO/2010/005197; Centrifugal force-based microfluidic device for nucleic acid detection and microfluidic system including the same, заявка на патент США 20090035847. Например, одно из устройств включает вращающуюся платформу (CD-диск), содержащую блок для экстрации целевой НК и блок для проведения ПЦР. Процедура обработки образца для выделения НК включает сорбцию на магнитных частицах; лизис происходит при облучении сорбированных клеток лазером. Описана процедура выделения НК из цельной крови, содержащей вирус гепатита С, с использованием вышеописанного устройства. Весь процесс выделения, включая перемешивание с магнитными частицами, конъюгированными со специфическими антителами, удаление остатка плазмы, промывку и экстракцию НК, занимает 12 мин (Cho Y.K., Lee J.G., Park J.M., Lee B.S., Lee Y., Ко С, One-step pathogen specific DNA extraction from whole blood on a centrifugal microfluidic device, Lab Chip, 2007, v. 7 (5), p.565-573).

Фирмой Nanogen (США) подана заявка на патент, касающийся устройства, состоящее из одного или нескольких дисков, причем жидкость перемещается как в плоскости одного диска, так и с одного диска на другой (Counter-centrifugal force device, WO/2009/079051, PCT/US2008/077087).

В патенте США 7,592,172, Rotatable sample disk and method of loading a sample disk компании Applied Biosystems (США) описана конфигурация диска, который позволяет при вращении перемешать образец от одного блока резервуаров к другому, например, от блока для хранения биологического материала к блоку проведения амплификации ДНК и др. Патентная заявка WO/2003/083491 компании Centrifluidics (США) «Method and apparatus for controlling fluid movement in a microfluidic system» описывает микрофлюидную платформу, содержащую множество резервуаров и каналов для перемещения жидкостей, которая может менять ориентацию относительно оси вращения, изменяя таким образом направление движения потоков жидкостей.

Институтом молекулярной биологии РАН (ИМБ РАН) получен патент РФ 2380418 «Сменный микрофлюидный модуль для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов и способ выделения и очистки нуклеиновых кислот с его использованием» и патент РФ на полезную модель 84381 «Устройство для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот». Способ предусматривает фильтрацию биологического образца через мембрану, задерживающую микроорганизмы и/или вирусы, лизис клеток на мембране, очистку НК на колонке с твердофазным сорбентом, причем все манипуляции выполняются внутри сменного микрофлюидного модуля, изолирующего образец от внешней среды. Сменный микрофлюидный модуль содержит резервуары для реагентов и реакционные объемы, микроканалы и клапаны. Устройство состоит из картриджа, содержащего резервуары с реагентами для лизиса, очистки и элюции НК, каналы, микроколонки и клапаны, и управляющей установки-контроллера, осуществляющей подачу давления, нагрев, перемешивание реагентов и перемещение реакционных смесей и растворов в резервуарах картриджа. Поскольку перемещение газожидкостных потоков внутри модулей осуществляется через систему пневматических клапанов, неизбежны потери НК при проведении процедуры выделения. Кроме того, способ и устройство предполагают выделение НК только из одного образца.

Кроме патентов ИМБ РАН, патентный поиск по патентам РФ не выявил патентов или заявок, касающихся способов и/или устройств для автоматизированного выделения и очистки НК. Имеются лишь патенты и заявки, касающиеся способов выделения НК в ручном режиме (например, патент РФ 2400537 «Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот», патент РФ 2382081 «Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот», заявка на изобретение РФ 2010115908 «Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот»).

Для известных к настоящему времени относительно простых устройств, осуществляющих выделение и очистку НК в автоматическом режиме, характерны следующие недостатки:

- устройства не проводят полный цикл обработки образца: требуется проведение одной или нескольких предварительных стадий в ручном режиме;

- степень очистки НК и выход очищенного препарата недостаточно высоки;

- устройства неуниверсальны, т.е. осуществляют выделение НК из биологических образцов определенного типа либо анализа образца на один тип заболевания;

- не все устройства позволяют обрабатывать инфекционные образцы;

- не все устройства дают возможность проводить одновременное выделение НК из нескольких биологических образцов.

Ряд зарубежных компаний производят и продают полностью автоматизированные системы, выполняющие одновременную обработку нескольких биологических образцов и удовлетворяющие современным требованиям, предъявляемым к работе с биологическим материалом. Все они являются сложными конструкциями, которые, как правило, воспроизводят процедуру «ручного» выделения ДНК и РНК, включая последовательное перемещение пробирок и многоканальное дозирование реагентов с использованием роботов.

Компанией Corbett Technologies (Австралия) разработана настольная рабочая станция "Х-tractor GeneTM System" для экстракции НК из образцов объемом до 200 мкл, полностью воспроизводящая ручное выделение НК, включающее последовательное перемещение пробирок, фильтрацию, дозирование реагентов.

Компанией Bioneer Corp. изготавливается устройство для автоматической очистки ДНК (Automatic DNA purification apparatus, патентная заявка WO/2001/025482), состоящее из многочисленных контейнеров для растворов, каналов для прохождения жидкостей, регулируемых клапанами, вакуумного блока, штативов, шприцов для точного количественного введения и отсасывания жидкостей. Устройство воспроизводит ручную процедуру выделения ДНК, но в автоматическом режиме.

Роботизированные системы COBAS AmpliPrep компании Roche Diagnostics (США/Швейцария), Thermos Kingfisher компании Thermo Electron (США), QIAsymphony SP и BioRobot MDx компании Qiagen (Германия), автоматическая рабочая станция ABI PRISM компании Applied Biosystems (США), предназначенные для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических жидкостей, таких как сыворотка и плазма крови, слюна, моча, основаны на применении магнитных частиц. Все эти системы позволяют одновременно обрабатывать несколько биологических образцов, например, 24 образца физиологических жидкостей в устройстве Thermos KingFisher, 96 образцов для выделения вирусных НК или геномной ДНК из образцов крови в приборе QIAsymphony SP. Технология выделения в устройствах фирмы Qiagen основана на применении колонок с магнитными частицами, поверхность которых содержит конъюгат никеля с агарозой. Система состоит из картриджей, заполненных необходимыми реагентами, из которых дозированно подаются растворы и ферменты для обработки клинического образца в процессе выделения НК. Картриджи в процессе выделения открываются автоматически, что сводит к минимуму риск заражения или контаминации.

Фирмой bioMerieux (Франция) производятся автоматизированные системы с минимумом ручных операций для выделения НК на основе магнитного устройства NucliSENS EasyMAG, которое удерживает магнитные частицы с адсорбированными нуклеиновыми кислотами, обеспечивая таким образом очистку НК в ходе нескольких отмывок. Объем анализируемого образца составляет от 10 до 100 мкл, время экстракции - 40-60 мин. Перед введением образца в устройства необходимо провести лизиса образцов в ручном режиме.

Устройство «Maxwell® 16 System» фирмы Promega (США) представляет собой систему картриджей, заполненных необходимым реагентами для обработки биологического образца, включающими буфер для лизиса, растворы для промывки, раствор, содержащий магнитные частицы (микросферы) с силикагелевой поверхностью. Картриджи помещаются в прибор, в котором в автоматическом режиме осуществляется обработка образца. Система дает возможность проводить очистку НК одновременно из 16 образцов. Очищенные образцы пригодны для проведения ПЦР. Система позволяет обрабатывать только образцы крови.

Система GeneXpert фирмы Cepheid (США) является сложным интегрированным устройством, в котором производятся все стадии обработки образца (мокрота, кровь, моча, соскобы тканей человека), необходимые для анализа ДНК методом ПЦР: выделение ДНК из образца, ПЦР-амплификация в реальном времени, флуоресцентная детекция. Образец вводится в одноразовый микрофлюидный картридж, заполненный необходимыми реагентами, который далее помещается в аппарат, где все операции проводятся в автоматическом режиме. Возможна одновременная обработка 16 образцов.

Стоимость сложных роботизированных систем, осуществляющих полный цикл выделения и очистки НК из нескольких биологических образцов, составляет несколько миллионов рублей. Эти устройства являются закрытыми системами: адаптация диагностических наборов других производителей под данные системы невозможна, и при эксплуатации необходимы постоянные закупки реагентов фирмы, предназначенные для данного конкретного прибора. Кроме того, эти системы, как и более простые устройства, не являются универсальными, т.е. способны обрабатывать образцы только определенного типа либо проводить анализа образца на определенный тип заболевания.

Таким образом, несмотря на большое количество патентов и заявок, касающихся устройств, осуществляющих выделение и очистку НК в автоматическом режиме, к настоящему времени не существует относительно простого универсального устройства, которое позволяет быстро, воспроизводимо и с высоким выходом осуществлять полный цикл выделения НК одновременно из нескольких биологических образцов. Предлагаемая полезная модель позволяет проводить выделение и очистку НК одновременно из нескольких образцов, содержащих клетки, бактерии, вирусы, цельную кровь, плазму крови, слюну и др. Процедура выделения происходит в автоматическом режиме внутри модулей, содержащих все необходимые реагенты, и расположенных на вращающейся платформе. Процедура выделения и очистки НК происходит быстро (около 40 мин) и с высоким выходом (более 90%). Полученные препараты НК можно непосредственно использовать для проведения гибридизации, амплификации и/или последующих молекулярно-генетических анализов.

Фиг.1 представляет (А) конструктивные элементы устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из нескольких биологических образцов и (Б) конструктивные элементы одноразового модуля, используемого в данном устройстве. Обозначения: 1 - вращающаяся платформа, на которой расположена совокупность сменных модулей; 2 - сменный модуль; 3 - электродвигатель; 4 - компрессор; 5 - блок воздушных клапанов; 6 - блок формирования воздушных потоков; 7 - блок распределения воздушных потоков; 8 - нагреватель; 9 - блок перемешивания; 10 - блоки питания; 11 - блок электронного управления; 12 - крышка; 13 - корпус; 14 - базовый рабочий сегмент сменного модуля; 15 - прокладка сменного модуля; 16 - крышка сменного модуля; 17 - фиксирующие винты сменного модуля.

Фиг.2 представляет фотографию устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из нескольких биологических образцов (А - крышка устройства закрыта, Б - крышка устройства поднята).

На Фиг.3 представлены (А) фотография сменного модуля; на переднем плане - крышка с силиконовой прокладкой и основная рабочая платформа, на заднем плане - сменный модуль в сборе, и (Б) фотография платформы с 24 модулями.

На Фиг.4 показана функциональная схема сменного одноразового модуля для автоматизированного выделения и очистки НК. Резервуары: Р1 - резервуар для первого лизирующего буфера, одновременно являющийся приемной камерой для биологического образца; Р2 - резервуар для второго лизирующего буфера; Р3 - резервуар, содержащий спирт; Р4 - резервуар, содержащий водно-спиртовую смесь; Р5 - резервуар для первого промывочного буфера; Р6 - резервуар для второго промывочного буфера; Р7 - резервуар с буфером для элюции НК с твердофазного сорбента; Р8 - резервуар с твердофазным сорбентом; Р9 - полость-разделитель жидкостных потоков; Р10 - резервуар для сбора отходов; P11 - резервуар для сбора очищенных НК; К - запорный клапан давления; П - пробка.

Фиг.5 представляет схему пневматических соединений, используемую в устройстве для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из нескольких биологических образцов. Обозначения: 4 - компрессор; 5 (а-д) - воздушные клапаны, составляющие блок воздушных клапанов; 18 - канал подачи нагретого воздуха; 19 (а-д) - штуцеры.

На Фиг.6 показан блок формирования воздушных потоков, встроенный в крышку устройства. Обозначения: 6а - неподвижная часть блока формирования воздушных потоков; 6б - подвижная часть блока формирования воздушных потоков; 12 - крышка устройства; 18 - канал подачи нагретого воздуха; 20 (а-д) - трубки для воздушных потоков.

Фиг.7 представляет (А) блок распределения воздушных потоков, выполненный в виде диска (показана сторона диска, которая соприкасается с совокупностью модулей) и (Б) платформу с модулями с зафиксированным над ней блоком распределения воздушных потоков (вид сверху) для устройства для одновременного выделения и очистки НК из 24-х образцов с использованием модулей, показанных на Фиг.4. Обозначения: 21 - отверстия для подачи давления в резервуары модулей Р7; 22 - отверстия для подачи давления в резервуары Р6; 23 - отверстия для подачи давления в резервуары Р2; 24 - отверстия для подачи давления в резервуары Р5; 25 - отверстия для отвода подогретого воздуха из модулей; 26 - отверстия для позиционирующих шпилек; 27 - позиционирующие шпильки с резьбовыми шайбами; 28 - отверстия для подачи подогретого воздуха.

Фиг.8 представляет диалоговое окно интерфейса программного обеспечения, отображаемое на дисплее устройства при проведении процедуры выделения и очистки НК.

Фиг.9 представляет результаты выделения НК из бактериальных клеток. Электрофорез в 1% агарозном геле.

А. Выделение НК из клеток Bacillus thuringiensis (образцы, содержащие 108 КОЕ/мл). Дорожки:

1 - препарат НК, полученный стандартным методом из 300 мкл образца;

2 - препарат, полученный из 300 мкл образца с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов,;

3 - молекулярный маркер /Hind III.

Б. Выделение НК из клеток Е. coli (образцы, содержащие 108 КОЕ/мл). Дорожки:

1 - молекулярный маркер GeneRulerTM High Range DNA Ladder («Ферментас», Литва);

2 - препарат НК, полученный стандартным методом из 500 мкл образца;

3 - препарат НК, полученный из 500 мкл образца с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов;

4 - препарат НК, полученный стандартным методом из 100 мкл образца;

5 - препарат НК, полученный из 100 мкл образца с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов.

Фиг.10 представляет результаты ПЦР при амплификации ДНК фага , выделенного из инфицированных фагом клеток E.coli. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:

1 - отрицательный контроль: препарат НК, полученный из неинфицированных фагом клеток E.coli с использованием стандартного метода выделения;

2, 3, 4 - препараты НК, полученные из инфицированных фагом клеток E.coli с использованием стандартного метода выделения (10 8 клеток в 1 мл исходного образца);

5 - отрицательный контроль: препарат НК, полученный из неинфицированных фагом клеток E.coli с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов;

6 - препарат НК, полученный из инфицированных фагом клеток E.coli с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов (107 клеток в 1 мл исходного образца);

7, 8 - препараты НК, полученные из инфицированных фагом клеток E.coli с использованием устройства для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов (108 клеток в 1 мл исходного образца);

9 - молекулярный маркер «100 bp Ladder» (Силекс, Россия). Стрелкой показан целевой ПЦР-продукт длиной 220 п.н. Слабо светящиеся размытые полосы внизу - праймеры для амплификации.

Устройство для одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов состоит из следующих конструктивных элементов (Фиг.1А):

совокупность сменных модулей, каждый из которых является сегментом кругового цилиндра и содержит резервуары с реагентами, необходимыми для выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов, резервуар для сбора отходов, резервуар для сбора очищенных нуклеиновых кислот, каналы, клапаны и полость-разделитель жидкостных потоков, и в каждом из которых происходит выделение и очистка нуклеиновых кислот из одного биологического образца;

вращающаяся платформа с размещенными на ней сменными модулями,

установленная на вал электродвигателя;

электродвигатель;

блок воздушных клапанов;

компрессор;

блоки питания;

блок электронного управления;

блок перемешивания смесей;

распределитель воздушных потоков;

блок формирования воздушных потоков;

нагреватель;

корпус с крышкой и запорным механизмом.

Биологические образцы, из которых проводится выделение НК, помещают в приемную камеру сменных модулей. Перемещение жидкостей и реакционных смесей в процессе обработки биологических образцов внутри сменных модулей происходит либо под действием сил, возникающих при вращении платформы, либо при подаче избыточного давления в соответствующие резервуары модулей. Вращение платформы по и против часовой стрелки осуществляется электродвигателем, избыточное давление в резервуарах модулей создается компрессором.

Конструктивными элементами модуля, используемого в данном устройстве (Фиг.1Б), являются: базовый рабочий сегмент 14, содержащий резервуары с реагентами, необходимыми для выделения и очистки НК, резервуар для сбора отходов, резервуар для сбора очищенных НК, каналы, клапаны и полость-разделитель жидкостных потоков, эластичная прокладка 15 и крышка 16. Элементы модуля могут быть склеены друг с другом или соединены с помощью фиксирующих винтов 17, как на Фиг.1Б.

На вращающуюся платформу устанавливают совокупность сменных модулей, каждый из которых содержит все необходимые реагенты для обработки биологического образца. Если образцов меньше, чем количество модулей, на которое рассчитано устройство, то на место неиспользуемых модулей устанавливают имитаторы модулей для того, чтобы платформа с модулями была полностью заполнена. Это является необходимым условием работоспособности устройства, так как подача давления и подогретого воздуха в резервуары модулей, а также балансировка платформы с модулями осуществляется только при условии полной загрузки платформы. Имитаторы модулей имеют массу, равную массе рабочих модулей для обеспечения балансировки при вращении, и внешние каналы, аналогичные каналам рабочих модулей для подачи подогретого воздуха.

Количество модулей в устройстве определяется геометрией устройства, размерами модулей и объемом обрабатываемого образца. В одном из воплощений полезная модель представляет собой устройство для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов при объеме каждого образца от 300 до 500 мкл. Фотография устройства с открытой и закрытой крышкой приведена на Фиг.2; блок формирования воздушных потоков с нагревателем встроен в крышку устройства.

Фотография сменного модуля, используемого в устройстве для одновременного автоматизированного выделения и очистки НК из 24-х биологических образцов приведена на Фиг.3А. Фиг.3Б представляет фотографию платформы, на которой установлены 24 сменных модуля.

Образцы с помощью любого дозирующего устройства вносят в приемные камеры сменных модулей. Процедура выделения и очистки НК из биологических образцов, включающая лизис клеток, бактерий и/или вирусных частиц, очистку и элюцию НК, производится в автоматическом режиме изолированно от внешней среды и одновременно во всех модулях. В каждом из модулей происходит выделение и очистка НК из одного биологического образца.

Способ выделения и очистки НК, используемый в данном устройстве (полезной модели), описан в заявке на патент РФ «Способ одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов», заявка 2010115908, дата приоритета 22.04.2010 г. Способ включает последовательное прохождение следующих стадий обработки образца внутри модулей:

а) первая стадия лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием первого лизирующего буфера, содержащего лизоцим или его аналоги;

б) вторая стадия лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием второго лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеолитический фермент, детергент;

в) добавление спирта к полученным лизатам биологических образцов для создания оптимальных условий связывания НК с твердофазным сорбентом;

г) связывание НК на твердофазном сорбенте;

д) отмывка НК, связанных с твердофазным сорбентом, от примесей последовательным пропусканием раствора промывочного буфера, содержащего хаотропный агент, и водно-спиртовой смеси;

е) элюция НК с твердофазного сорбента пропусканием элюирующего раствора. Способ характеризуется тем, что он использует перемещение жидкостей по каналам и между резервуарами модулей под действием сил, вызванных вращением платформы, на которой расположены модули; перемещение жидкостей может также осуществляться при создании разницы давлений в соответствующих резервуарах модуля. В качестве хаотропного агента, входящего в состав лизирующего буфера и буфера для промывки, используют гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид. Твердофазный сорбент для связывания НК выбирают из группы сорбентов, включающей силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло. Модули изготовлены из материала, выбранного из группы полимеров, не сорбирующих НК, включающей оргстекло, полипропилен, поликарбонат. Материал для прокладки модуля выбирают из группы эластичных материалов, не сорбирующих НК, включающей силикон, полиэтилен. В качестве биологических образцов используют цельную кровь, сыворотку крови, плазму крови, слюну или культуральные жидкости, содержащие клетки, микроорганизмы и/или вирусные частицы.

Функциональная схема сменного одноразового модуля для автоматизированного выделения и очистки НК, который используется в одном из воплощений устройства, приведена на Фиг.4. Резервуар Р1 содержит сухую (лиофилизованную) смесь для первого лизирующего буфера. При поступлении жидкого биологического образца в резервуар Р1 происходит растворение сухой реакционной смеси буфера и одновременно первая стадия лизиса.

Резервуар Р2 содержит сухую (лиофилизованную) смесь для второго лизирующего буфера. При поступлении лизата после первой стадии лизиса из резервуара Р1 происходит растворение сухой реакционной смеси буфера и одновременно вторая стадия лизиса.

Резервуар Р5 содержит сухую (лиофилизованную) смесь для промывочного буфера. Растворение сухой смеси происходит при поступлении в резервуар Р5 водно-спиртовой смеси из резервуара Р4.

В данном воплощении устройства резервуары (Фиг.4) расположены таким образом, что перемещение жидкостей и реакционных смесей из резервуаров Р1 и Р3 в резервуар Р2, из резервуара Р4 - в резервуар Р5, из резервуара Р8 - в полость-разделитель жидкостных потоков Р9 и далее из полости-разделителя Р9 - в резервуары Р10 или Р11 осуществляется под действием центробежных сил при вращении платформы с модулями. Конструкция модуля не допускает перемещения жидкостей из резервуаров Р2, Р5, Р6 и Р7 при вращении платформы. Перемещение жидкостей и реакционных смесей из резервуаров Р2, Р5, Р6 и Р7 в резервуар Р8 происходит при подаче избыточного давления, создаваемого компрессором, в соответствующий резервуар.

Выход из резервуара Р3, содержащего спирт, закрыт запорной пробкой П, удерживающей спирт от перетекания в резервуар Р2 до завершения второй стадии лизиса. Запорная пробка остается закрытой при вращении платформы с модулями с частотой, при которой происходит перемещение реакционной смеси из резервуара Р1 в резервуар Р2 (около 5000 об/мин для одного из воплощений устройства). После завершения лизиса в резервуаре Р2 начинается вращение платформы с модулями с частотой более 6500 об/мин. При этом запорная пробка открывается и содержимое резервуара Р3 (спирт) перетекает в резервуар Р2 для осуществления следующей стадии обработки образца: создания оптимальных условий связывания НК с твердофазным сорбентом.

Выход из резервуара с твердофазным сорбентом Р8 (Фиг.4) перекрыт запорным клапаном давления К, перекрывающим выход жидкости. Клапан открывается при вращении платформы на частотах выше 5000 об/мин и закрывается при торможении платформы. При подаче давления в резервуар Р2 реакционная смесь перемещается в резервуар Р8, где происходит связывание НК на твердофазном сорбенте. Далее происходит вращение платформы, и на оборотах выше 5000 об/мин запорный клапан открывается, и жидкость перетекает в полость-разделитель Р9; при остановке вращения клапан закрывается. То же самое происходит как при промывке твердофазного носителя, так и при элюции НК: при подаче давления в соответствующий резервуар промывочный буфер или буфер для элюции подается в резервуар Р8 при закрытом клапане и неподвижной платформе; далее осуществляется вращение платформы. Клапан открывается при частоте в 5000 об/мин, и жидкость перетекает в полость-разделитель Р9.

В полости-разделителе жидкостных потоков Р9 перемещение жидкостей определяется центробежной силой и силой Кориолиса и зависит от направления вращения платформы. При вращении платформы с модулями по часовой стрелке при расположении резервуаров, показанном на Фиг.4, поток жидкости (растворы после промывки твердофазного сорбента) направляется в резервуар для отходов Р10, а при вращении против часовой стрелки поток жидкости (очищенный препарат НК) направляется в резервуар для сбора очищенных продуктов P11.

Платформа с модулями установлена на вал электродвигателя, осуществляющего вращение по и против часовой стрелки при проведении процедуры выделения и очистки НК. Избыточное давление воздуха в резервуарах модулей создается компрессором, представляющим собой, например, мембранный насос. Компрессор подает давление на блок формирования воздушных потоков и далее на распределитель воздушных потоков, через который происходит подача воздушных потоков непосредственно в резервуары сменных модулей.

Схема пневматических соединений для одного из воплощений устройства, осуществляющего одновременное выделение и очистку НК из 24-х биологических образцов с использованием сменных модулей, изображенных на Фиг.4, представлена на Фиг.5. Подача воздуха на блок формирования воздушных потоков и для управления блоком формирования воздушных потоков осуществляется через систему воздушных клапанов (клапаны 5а-д на Фиг.5). В данном воплощении устройства компрессор 4 (Фиг.5) формирует два воздушных потока, один из которых имеет давление в 1,5 атм и служит для перемещения подвижных узлов блока формирования воздушных потоков. Второй поток с давлением 0,1 атм служит для перемещения смесей в резервуарах модулей. Воздушный поток с давлением 0,1 атм разветвляется на четыре потока в соответствии с числом резервуаров в каждом из модулей, в которые подается давление (резервуары Р2, Р5, Р6 и Р7 на Фиг.4).

Через воздушные клапаны 5а-д, штуцеры 19а-д (Фиг.5) и трубки 20 а-д (Фиг.6) все потоки поступают на блок формирования воздушных потоков.

Блок формирования воздушных потоков состоит из неподвижной (6а) и подвижной (6б) деталей в форме дисков (Фиг.6). Детали прикреплены к крышке устройства (12), в центре которой имеется канал (18) для подачи подогретого воздуха от нагревателя. В подвижном диске (6б) имеются кольцевые уплотнения из эластичного материала, соответствующие числу формируемых каналов плюс 1, т.е. 5 уплотнений для данного воплощения устройства. При подаче давления в 1,5 атм (поток с высоким давлением) на блок формирования движущийся диск опускается на блок распределения воздушных потоков, обеспечивая соединение каналов, по которым потоки с низким давлением (0,1 атм) подаются в соответствующие резервуары модулей (крышка устройства при этом закрыта). При отключении высокого давления срабатывает возвратная пружина, возвращающая диск в исходное положение.

После блока формирования воздушные потоки поступают в блок распределения, служащий для подачи воздушных потоков в соответствующие резервуары сменных модулей. Фотография блока распределения воздушных потоков для воплощения устройства для одновременной обработки 24-х образцов с использованием модулей, показанных на Фиг.4, приведена на Фиг.7.

Блок распределения воздушных потоков представляет собой диск, соосный с вращающейся платформой и расположенный над совокупностью сменных модулей. Воздушные потоки поступают в резервуары сменных модулей через специальные отверстия в диске. Блок распределения с помощью нескольких шпилек закреплен над совокупностью модулей и вращается вместе с модулями в ходе обработки образцов. В блоке распределения имеются 24 отверстия для подачи давления в резервуары Р2 24-х модулей, 24 отверстия для подачи давления в резервуары Р5 24-х модулей, 24 отверстия для подачи давления в резервуары Р6 24-х модулей, 24 отверстия для подачи давления в резервуары Р7 24-х модулей. Имеются также 24 отверстия для отвода подогретого воздуха из модулей, а также отверстия для позиционирующих шпилек. Имеются также 6 отверстий для подачи подогретого воздуха (Фиг.7). Все отверстия расположены по окружностям диска на разных радиусах.

Нагревание жидкостей и реакционных смесей в резервуарах модулей осуществляется путем пропускания подогретого воздуха через специальный канал в крышке устройства (канал 18 на Фиг.5 и 6) в блок формирования воздушных потоков и далее через систему внешних каналов, сформированных совокупностью модулей. Совокупность модулей включает как рабочие модули, в которые помещены биологические образцы, так и имитаторы модулей, имеющие внешние каналы, аналогичные рабочим модулям.

Подогрев воздуха осуществляется нагревателем, например, феном, расположенным в блоке формирования воздушных потоков. Отвод подогретого воздуха осуществляется через систему отверстий в блоке распределения воздушных потоков (отверстия 25 на Фиг.7).

Перемешивание растворов и реакционных смесей в сменных модулях осуществляется перемешивающим устройством, например, вибрационного типа.

Блок электронного управления включает ЭВМ с устройствами связи с компрессором, блоком воздушных клапанов, нагревателем, блоком перемешивания, запорным механизмом в крышке устройства, частотным преобразователем, задающим режимы работы электродвигателя. Блок электронного управления реализует программу выделения и очистки НК и обеспечивает визуальный контроль над стадиями процесса выделения и очистки НК. Стадии обработки образца отображаются на дисплее устройства, где приводится общая функциональная схема процесса, происходящего одновременно во всех модулях (Фиг.8).

Блок электронного управления и блок клапанов питаются от собственных специализированных блоков питания. Компрессор, нагреватель, электродвигатель, блок перемешивания запитаны сетевым напряжением.

Крышка устройства снабжена запорным механизмом, блокирующим работу устройства при открытом замке крышки, что обеспечивает безопасность персонала при работе с устройством, включая безопасность в режиме вращения платформы.

Процедура выделения и очистки НК из нескольких биологических образцов с использованием воплощения устройства для одновременной обработки 24-х образцов и сменных модулей, показанных на Фиг.1Б и Фиг.4, происходит следующим образом:

(1) Биологические образцы помещают в приемные камеры модулей с помощью пипетки или любого дозирующего устройства.

(2) Сменные модули с образцами устанавливают на платформу (Фиг.3Б). Если модулей с образцами меньше, чем количество модулей, на которое рассчитано устройство, на место отсутствующих модулей устанавливают имитаторы модулей, чтобы платформа была полностью заполнена.

(3) Над платформой с модулями устанавливают блок распределения воздушных потоков (Фиг.7Б) и закрывают крышку устройства.

(4) Включают устройство и запускают процедуру выделения НК в автоматическом режиме путем нажатия на пиктограмму «START» диалогового окна интерфейса ПО на дисплее комплекса (Фиг.8).

(5) Процесс выделения и очистки НК включает следующие стадии, происходящие одновременно внутри каждого модуля (Фиг.4):

а) После введения биологического образца в приемную камеру (Фиг.4, резервуар Р1) происходит его обработка первым лизирующим буфером (10 мМ трис-HCl буфер, содержащий 1 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 50 мг/мл лизоцима, рН 8,0). Обработка проводится при нагревании резервуара Р1 до 37°С и перемешивании. Длительность стадии составляет 5 минут. Стадия заканчивается закручиванием платформы модулей с частотой 540 об/мин в течение 30 сек, в результате чего происходит перемещение жидкости из резервуара Р1 в резервуар Р2. Запорная пробка в резервуаре Р3, содержащем этанол, на этой частоте вращения остается на месте, удерживая этанол от перетекания в резервуар Р2.

При вращении платформы растворитель первого промывочного буфера (водно-спиртовая смесь) из резервуара Р4 перетекает в резервуар Р5, где происходит растворение сухой смеси и приготовление первого промывочного буфера (0,15 М трис-HCl буфер, содержащий, 0,05 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 5 М гуанидинтиоцианата, рН 8,0).

б) После прекращения вращения платформы происходит обработка образца в резервуаре Р2 вторым лизирующим буфером (10 мМ трис-HCl буфер, содержащий 1 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 4,5 М гуанидингидрохлорида, 1 мг/мл протеиназы К, 0,5% Тритон Х-100, рН 8,0). Процесс происходит при нагревании резервуара Р2 до 60°С и перемешивании. Одновременно продолжается приготовление первого промывочного буфера в резервуаре Р5 при нагревании резервуара до 60°С и перемешивании.

Далее платформа модулей раскручивается до частоты 6600 об/мин на 30 сек. На этой частоте открывается запорная пробка в резервуаре Р3, и этанол перетекает в резервуар Р2, содержащий лизат биологического образца. Длительность стадии составляет 12 мин.

в) После прекращения вращения платформы в резервуар Р2 подается избыточное давление 0,1 атм, и лизат, содержащий спирт, из резервуара Р2 перемещается в резервуар Р8, содержащий твердофазный сорбент, например, силикагель G60 (Merck, Германия). Происходит сорбция НК на сорбенте. Дальнейший путь жидкости перекрыт установленным на выходе из резервуара Р8 клапаном давления. Длительность стадии составляет 30 сек.

г) Далее платформа модулей раскручивается по часовой стрелке до частоты 6600 об/мин на 30 сек. На этой частоте открывается клапан давления, установленный на выходе из резервуара Р8, и жидкость попадает в полость-разделитель потоков Р9. Под действием силы Кориолиса жидкостной поток отклоняется к левой (по направлению потока) стенке полости и попадает в резервуар для отходов Р10. По окончании стадии платформа модулей останавливается. При торможении платформы на частотах ниже 5000 об/мин выходной клапан давления закрывается. Длительность стадии составляет 4 мин.

д) После прекращения вращения платформы в резервуар Р5 подается избыточное давление 0,1 атм, и первый промывочный буфер перемещается в резервуар Р8. Дальнейшему перетеканию буфера препятствует клапан давления на выходе из резервуара Р8. Платформа модулей раскручивается по часовой стрелке до частоты 6600 об/мин на 30 сек. Аналогично стадии (г), жидкость после промывки твердофазного носителя попадает в полость-разделитель потоков Р9 и далее в резервуар для отходов Р10. Длительность стадии составляет 5 мин.

е) После прекращения вращения платформы избыточное давление 0,1 атм подается в резервуар Р6, и второй промывочный буфер (80% спирт) перемещается в резервуар Р8. После этого платформа модулей раскручивается по часовой стрелке до частоты 6600 об/мин на 30 сек. Аналогично стадии (г), жидкость после промывки твердофазного носителя попадает в полость-разделитель потоков Р9 и далее в резервуар для отходов Р10. Длительность стадии составляет 5 мин.

ж) После прекращения вращения платформы избыточное давление 0,1 атм подается в резервуар Р7, содержащий буфер для элюции НК (0,15 М трис-HCl буфер, содержащий 0,05 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,0, или вода), и буфер для элюции в объеме 100 мкл перемещается в резервуар Р8.

з) Далее платформа модулей раскручивается против часовой стрелки до частоты 6600 об/мин. Открывается клапан давления, установленный на выходе из резервуара Р8, и жидкость попадает в полость-разделитель потоков Р9. Под действием силы Кориолиса жидкостной поток отклоняется к правой (по направлению потока) стенке полости и попадает в резервуар для сбора продуктов Р11. Время прохождения стадии составляет 7 мин.

(6) Выключают устройство, и из каждого модуля вынимают пробирку с очищенными НК.

Общее время выделения и очистки НК с использованием устройства составляет 40 мин. Полученные препараты НК могут быть использованы без дополнительной очистки для проведения гибридизации, амплификации и/или последующих молекулярно-генетических анализов.

Результаты выделения НК и проведения ПЦР с полученными препаратами НК, выделенными из биологических образцов с использованием полезной модели для одновременной обработки 24-х биологических образцов, показаны на Фиг.10 и 11. В качестве метода сравнения использовали стандартную процедуру выделения и очистки ДНК в «ручном» режиме, включающую лизис, экстракцию смесью фенол-хлороформ, переосаждение НК этанолом. Во всех случаях количество и концентрация НК, выделенных автоматизированным и стандартным методами, различались не более, чем на 20%. При выделении геномной ДНК из 24-х одинаковых образцов, содержащих клетки Е. coli (108 КОЕ/мл) (Фиг.10 Б), выход ДНК составил 5,1±0,4 мкг (~90%).

Полезная модель позволяет проводить выделение НК клеток микроорганизмов и/или вирусов одновременно из нескольких образцов в автоматическом режиме с высоким выходом за 40 мин; для выделения и очистки не требуется высококвалифицированного персонала. Поскольку все стадии выделения и очистки осуществляются внутри одноразовых сменных модулей, использование полезной модели исключает контакт оператора или исследователя с потенциально патогенным образцом.

1. Устройство для одновременного автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов, характеризующееся тем, что оно включает установленную на вал электродвигателя вращающуюся платформу с размещенными на ней сменными модулями, каждый из которых представляет собой сегмент кругового цилиндра и содержит резервуары с реагентами для выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов, резервуар для сбора отходов, резервуар для сбора очищенных нуклеиновых кислот, каналы, клапаны и полость-разделитель жидкостных потоков, и каждый из которых выполнен таким образом, что происходит выделение и очистка нуклеиновых кислот из одного биологического образца, компрессор, блок воздушных клапанов, блок формирования воздушных потоков, блок распределения воздушных потоков, нагреватель, блок перемешивания смесей, блоки питания, блок электронного управления, корпус с крышкой и запорным механизмом, при этом устройство выполнено таким образом, что перемещение жидкостей и реакционных смесей в процессе обработки биологических образцов внутри сменных модулей происходит либо под действием сил, возникающих при вращении платформы, либо при подаче избыточного давления в соответствующие резервуары модулей.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что установленная на вал электродвигателя платформа выполнена с возможностью вращения платформы по и против часовой стрелки.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что подача избыточного давления в резервуары сменных модулей осуществляется компрессором через блок формирования воздушных потоков и блок распределения воздушных потоков.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что подача воздуха на блок формирования воздушных потоков и для управления блоком формирования воздушных потоков осуществляется через систему воздушных клапанов.

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что блок формирования воздушных потоков состоит из неподвижной и движущейся деталей, каждая из которых выполнена в форме диска, прикрепленного к крышке устройства, причем при подаче давления на блок формирования воздушных потоков движущийся диск установлен с возможностью опускания на блок распределения воздушных потоков для обеспечения возможности соединения каналов, по которым потоки подаются в соответствующие резервуары модулей.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что блок распределения воздушных потоков для подачи воздушных потоков в соответствующие резервуары сменных модулей представляет собой диск с отверстиями, соосно размещенный с вращающейся платформой, и расположен над совокупностью сменных модулей, размещенных на платформе, таким образом, что воздушные потоки поступают в резервуары сменных модулей через отверстия в диске.

7. Устройство по п.1, отличающееся тем, что нагревание жидкостей и реакционных смесей в резервуарах модулей осуществляется путем пропускания подогретого воздуха через блок формирования воздушных потоков и далее через систему внешних каналов, сформированных совокупностью модулей, а подогрев воздуха осуществляется нагревателем, расположенным в блоке формирования воздушных потоков.

8. Устройство по п.1, отличающееся тем, что имеет перемешивающее устройство вибрационного типа для перемешивания растворов и реакционных смесей в сменных модулях.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к конструкциям центробежных экстракционных аппаратов и является усовершенствованием изобретения по патенту.
Наверх