Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина "ревакс вкт" против натуральной оспы и гепатита b для энтерального применения

Полезная модель относится к медицине, в частности, к иммунологии и может быть использована для специфической профилактики инфекционного вирусного гепатита В и натуральной оспы. Вакцина в виде таблетки с кислотоустойчивой оболочкой вызывает при низкой иммунизирующей дозе формирование защитного уровня специфического иммунитета. Бивакцина на основе вируса осповакцины для перорального применения содержит в одной таблетке лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ №2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 4,5-6,0 lg БОЕ на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин, пептон, желатозу и буфер. Рекомбинантный вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток животных при следующем соотношении компонентов ядра на одну таблетку (мас.%):

таблетку

лактоза остальное до 100%. Кислотоустойчивая оболочка таблетки перед ее 4-х кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов в весовых частях: шеллак - 10,0; кислота олеиновая- 2,0; аммиак водный 25%-ный -3,0; вода дистиллированная - 85,0.

Полезная модель относится к сухим формам вакцинных препаратов энтерального применения и может быть использована в медицине, в частности, в иммунологии для специфической профилактики вирусного гепатита В и натуральной оспы.

Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы для накожного применения в сухой лиофилизированной форме (патент РФ №2073524, МПК А 61 К 39/29; С 12 N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантного вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 (b7,5S2-S) с титром (3-5)×10⁸ ООЕ/мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Штамм рекомбинантного вируса

титром

Недостатками известной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки один пептон, что не достаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации,кроме того, необходимость использования высоких доз вакцины (>10⁷ ООЕ/мл) для иммунизации с целью получения специфических защитных титров антител, низкая производительность применения этого препарата при накожной вакцинации, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза инфицирования прививаемого пациента вирусами иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификацией возможно выделение вируса осповакцины в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.

Наиболее близким аналогом - прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе ВОВ для энтерального применения, содержащая в одной таблетке, покрытой кислоустойчивой оболочкой, лиофилизированный вирусный материал(наработанный на куриных эмбрионах - КЭ) на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 6,5-8,0 lg OOE на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин (патент РФ №2076735, МПК А 61 К 39/00; С 12 N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Недостатком известной таблетированной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки одну лактозу, что не достаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации и особенно таблетирования и необходимость использования относительно высоких доз вакцины (6,5-8,0 lg OOE на таблетку) для иммунизации с целью получения защитных специфических титров антител.Кроме того, активный вирусный материал нарабатывается на развивающихся КЭ, что не исключает содержание в препарате дополнительных примесей и его контаминацию посторонней микрофлорой, требует дополнительный биологический контроль.

Техническим результатом предлагаемой полезной модели является создание такой бивакцины против натуральной оспы и гепатита В, которая позволила бы получить вируссодержащий материал в более очищенном виде, обеспечить сохранение активности этого вируссодержащего материала в процессе лиофилизации и таблетирования, снизить вероятность контаминации готового препарата посторонней микрофлорой, а также упростить технологию производства и обеспечить возможность стандартизации основных технологических этапов получения вакцины, без потери активности достигать кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывать формирование защитного уровня специфического иммунитета.

Указанный технический результат достигается тем, что в таблетированной живой рекомбинантной бивакцине против натуральной оспы и гепатита В для

энтерального (через кишечник) применения, представляющей собой таблетку, состоящую из ядра и находящейся поверх ядра кислотоустойчивой оболочки, причем ядро включает лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 4,5-6,0 lg БОЕ на таблетку лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин. Согласно полезной модели, ядро таблетки дополнительно содержит пептон, желатозу и солевой буфер, а вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток животных при следующем соотношении компонентов в ядре на одну таблетку (мас.%):

Кислотоустойчивая оболочка таблетки перед ее 4-х кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов в весовых частях:

Механизм действия вакцины: таблетка с кислотоустойчивой оболочкой без потери активности достигает кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывает формирование защитного уровня специфического иммунитета на маркер гепатита В и вирус осповакцины.

На фиг.1 изображена таблетированная форма препарата в разрезе. Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В для энтерального применения содержит двояковыпуклую таблетку, состоящую из ядра 1 и находящейся поверх ядра 1 кислоустойчивой оболочки 2 (фиг.1). Таблетированная форма распадается в кишечном тракте под действием влаги, имеющей щелочную рН, и температуры организма.

Ниже приведены примеры 1-4 составов ядра 1 таблетки живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В энтерального применения (через кишечник).

Пример 1.

Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью 4,5 lg БОЕ на таблетку 1,04;

стеарат кальция 2,0 ванилин 0,2;

лактоза остальное до 100%.

Пример 2.

Пример 3.

Пример 4.

Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С 12 N 15/00, опубл. 1994 г.).

Желатоза - частично гидролизованный желатин - компонент стабилизатора; мочевина - хелатирующий агент, компонент стабилизатора. Лактоза (ТУ 6-09-2293-77), стабилизатор и наполнитель; сахароза (ГОСТ 5833-75), стабилизатор и

органолептик; стеарат кальция (ТУ 6-09-4233-76) - скользящая добавка; ванилин (ГОСТ 16599-71), органолептик.

Пример 5. Кислотоустойчивая оболочка 2 ядра 1 таблетки (фиг.1) перед ее 4-х кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов в весовых частях:

Пример 6.

Способ получения таблетированной живой рекомбинантной бивакцины "Ревакс ВКТ" с кислотоустойчивой оболочкой

Вначале проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена - методом ИФА и наличие встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК - методом ПЦР. Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-поду центах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержат примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/10⁶ клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.

После этого выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на питательной среде ДМЕМ с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Использованную среду сливают и монослой клеток помещают в роллерные бутыли объемом, например, 2 литра с питательной средой ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 2%-ной

эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют штаммом рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) с дозой заражения - 1,0-100,0 БОЕ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборотов в минуту до 50-70% цитопатического эффекта (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Ниже в таблице 1 приведены результаты культивирования.

Примечание. (*) - низкая плотность клеточного монослоя перед его инфицированием.

Далее питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), то есть в 10 раз меньшим, чем объем питательной среды. В качестве буферного раствора используют 0,1 М Tris для поддержания рН=8,8-9,0. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,1М Tris с рН 8,8-9,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 7,0 lg БОЕ/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем. Ниже в таблице 2 приведен рецептурный состав ядра таблеток с разной активностью вакцинного материала (в соответствии с примерами 1-4).

Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным, исходя из активности лиофильно высушенных материалов, находилось в диапазоне от 4,5 до 6,0 lg БОЕ/таблетку.

Таблетки покрывали кислотоустойчивой оболочкой следующего состава (масс.%):

25%-ный

Для приготовления 1 л раствора в колбу вместимостью 1 л, наливали 850 мл дистиллированной воды. Далее в нее вносили 20 г олеиновой кислоты. Содержимое колбы нагревали до температуры 80...90°С. К содержимому колбы добавляли 33 мл аммиака водного 25%-ного и тщательно перемешивали содержимое. После чего небольшими порциями в 5-6 приемов, при непрерывном перемешивании, вводили навеску шеллака массой 100 г. Содержимое колбы перемешивали до полного растворения шеллака. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры.

В приготовленный раствор с целью нанесения покрытия опускали таблетки 4-кратно (интервал между опусканиями 15 минут), беря каждую таблетку пинцетом за торцевую грань и при этом регулярно меняя место его расположения на этой грани.

Приготовленная таким образом серия таблеток представляла собой культуральную бивакцину против оспы и гепатита В для энтерального применения и имела специфическую активность - 4,8gБОЕ/табл. Таблетки имеют следующие биологические характеристики:

- по описанию: форма - круглая двояковыпуклая, края - цельные, диаметр -6 мм, цвет поверхности - темно-коричневый, а на изломе - серо-белый;

- по распадаемости: в растворе NaOH (рН-7,8) - деструкция покрытия через 20 минут, в растворе НС1 (рН-5,0) - отсутствие изменений в течение 1 часа;

- по подлинности: содержание на ХАО РКЭ однотипных ООЕ диаметром от 0,5 до 3,0 мм - 100%; продукция в ПЦР фрагмента 1150 п.о., содержащего расчетную встройку, размером 600 п.о., что соответствует pre s2-S - гену вируса гепатита В - наличие продукции фрагмента 1150 п.о.;

- по микробиологической чистоте: содержание бактерий - 4 KOE-табл^-1 , содержание дрожжевых и плесневых грибов (суммарно), менее 2 КОЕ-табл.^-

¹ ; бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aerugmosa и Staphylococcus aureus отсутствуют;

- по токсичности: для морских свинок в дозе 1 таблетка и белых мышей в дозе 1/25 таблетки - нетоксичны;

- по специфической активности: 4,81gБОЕ-табл ^-1, 150 нг/мл/ кл⁶ HbsAg. Экспериментальные исследования активности полученных таблеток с кислотоустойчивым покрытием показали, что в процессе приготовления таблеток бивакцины «Ревакс ВКТ» на базе лиофилизированного вирусного материала в присутствии стабилизирующей добавки не наблюдалось достоверной инактивация вирусного компонента. Расчетные данные по концентрации вируса в таблетках, как правило, совпадали с результатами раститровок вируса в таблетках.

Пример 7.

Данные по оценке реактогенности субстанции заявляемой бивакцины "Ревакс ВКТ"

Для оценки реактогенности субстанции заявляемой бивакцины была изучена динамика развития инфильтратов у кроликов, вакцинированных внутрикожно субстанциями штаммов ВОВ, полученными разными способами:

на основе заявляемого способа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на культурах клеток);

- на основе способа-прототипа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на КЭ;

- на основе способа-прототипа (при культивировании родительского штамма Л-ИВП на РКЭ);

Животных инфицировали по методу Гротта. Максимальное развитие инфильтрата у кроликов наблюдалось в месте введения 5 lg ООЕ/0,1 мл и 4 lg ООЕ/0,1 мл штаммов b7,5S2-S эмбрионального и Л-ИВП, на 4-е сутки после вакцинации. Причем, появление же инфильтратов в обоих случаях было зарегистрировано на вторые сутки после инфицирования. При этом наименьшие по площади инфильтраты образовывались при введении штамма b7,5S2-S эмбрионального (Р<0,05) по сравнению со штаммам Л-ИВП. В то же время внутрикожное введение кроликам 5 lg БОЕ/0,1 мл и 4 lg БОЕ/0,1 мл штамма b7,5S2-S культурального приводило к появлению инфильтратов на месте введения лишь на 7-е сутки с максимумом по площади на 8-е сутки. Кроме того, размеры этих инфильтратов были достоверно меньшими (Р<0,05) по сравнению даже с таковыми для штамма b7,5S2-S эмбрионального.

Полученные результаты свидетельствуют, что рекомбинантный штамм b7,5S2-S культурального происхождения обладает достоверно более низкой реактогенностью по сравнению с таковым эмбрионального происхождения.

Таким образом, заявляемая таблетированная бивакцина "Ревакс ВКТ", наработанная на перевиваемых культурах клеток животных, по сравнению с такой же таблетированной формой вакцины "Ревакс ВТ", наработанной на КЭ, менее реактогенна, так как содержит меньше посторонних примесей, не контаминируется посторонней микрофлорой, более технологична при изготовлении в промышленных масштабах.

Пример 8.

Экспериментальные данные испытания бивакцины «РЕВАКС

ВКТ» на добровольцах

С целью получения более объективных данных проведена однократная энтералъная (через кишечник) иммунизация таблетированной бивакциной «РЕВАКС ВКТ» с кислотоустойчивой оболочкой ранее не привитых против оспы добровольцев. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3Данные по энтералъной иммунизации бивакциной на добровольцах
Номер добровольца, (возраст)	Дни после вакцинации	Титр антител в -ции нейтрализции к вирусу оспы	Концяантител KHBs Ag, мМЕ/м л	Вирус в плазме, слюне и моче в течение 14 суток после вакцинации,в ООЕ/мл	Общие и местные реакции у добровольцев	Дата и иммунизирующая доза (БОЕ/мл) и серия бивакцины
15(18)	0 30Р	<1:5	Отр.	Отр.	Отсутствие местных и общих реакций	02.08.04. (1,6×105),Cl
		1:125-1:125	10	Отр.
16(18)	0 30Р	<1:5 1:125-	Отр. 30	Отр.	Отсутствие местных и общих реакций	02.08.04. (1,6×105),Cl
		1:625		Отр.
17(18)	0 30Р	<1:5	Отр. 40	Отр.	Отсутствие местных и общих реакций	02.08.04. (1,6×105),Cl
		1:125		Отр.
18(18)	0 30Р	<1:5	Отр.	Отр.	Отсутствие местных иобщих реакций	02.08.04. (1,6×105),Cl
		1:25	90	Отр.

Примечания:

1 Минимальной защитной концентрацией антител к HBs Ag в сыворотке крови людей в реакции иммуноферментного анализа является 10 мМЕ/мл;

2 Минимальным защитным титром антител к оспе в сыворотке крови людей в реакции нейтрализации является 1:20-1:25.

Механизм действия вакцины: таблетка с кислотоустойчивой оболочкой без потери активности достигает кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывает формирование защитного уровня специфического иммунитета на маркер гепатита В и вирус осповакцины.

Анализ таблицы 3 показывает, что все добровольцы имеют концентрацию антител к HBs Ag и титр антител к оспе в сыворотке крови, превышающие их минимальный защитный уровень, что подтверждает эффективность действия вакцины.

1. Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В для энтерального применения, содержащая таблетку, состоящую из ядра и находящейся поверх ядра кислотоустойчивой оболочки, причем, ядро включает лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ №2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 4,5-6,0 lg БОЕ на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин, отличающаяся тем, что ядро таблетки дополнительно содержит пептон, желатозу и солевой буфер, а рекомбинантный вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток животных - при следующем соотношении компонентов в ядре на одну таблетку, мас.%:

2. Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В для энтерального применения по п.1,отличающаяся тем, что кислотоустойчивая оболочка таблетки перед ее 4-кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов, вес.ч.: