Способ получения биомассы

 

ИЗОБРЕТЕНи

Союз Советскик

Социалистических

Республик

ОПИСА

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) .Заявлено28.02.77 (21) 2459353/2 (23) Приоритет — (32) /06

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (33) (31) Опубликовано 071280.Бюллетень М

Дата опубликования описания 0712.

92

8) Иностранцы

Кацухиса Осуги, Даизо Такеючи, Масахиро Хамада и Тамоцу Кано (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная Фирма

Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ

Изобретение относится к техйике выращивания микроорганизмов, используемых для получения биомассы на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода. 5

Известен способ получения биомассы путем культивирования микроорганизмов — бактерий рода Methylomonasна питательной среде.,содержащей метанол в качестве источника углерода, 10 источник азота и необходимые соли в условиях аэрации с последующим выделением биомассы одним из известных способов f1).

Недостатком известного способа является то, что используемые в нем микроорганизмы не обеспечивают достаточно эффективного использования метанола и имеют невысокую скорость роста, вследствие чего содержание 20 белка в биомассе невысокое и биомасса не может быть использована в качестве пищевой добавки.

Цель изобретения — повышение содержания белка в биомассе и возмож- 25 ность ее использования в качестве пищевой добавки.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения биомассы из рода бактерий Methylomonas 3O

2 используют. штамм Me thy lomonas probus

FE RM" P 9 3193, при этом культивирование ведут при температуре среды 3537 С и рН 6,3-7.

При этом концентрация метанола в . питательной среде составляет до

4 об.Ъ.

Кроме того, скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают е 40 л/ 20 л/мин до 60 л/

/20 л/мин.

Культивирование микроорганизмов осуществляют с постоянной скоростью аэрации среды, равной 10л/20 л мин или 20 л/20л/мин или 40 л/20л/мин или 60 л/20 л/мин или 80л/20 л/мин .или 100 л/20 л/мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы — бактерии рода

Methylomonas-штамм Methylomonas

probus FE RM-P 9 3193 культивируют на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода метанол,. при этом концентрация последнего в питательной среде не превышает

4 об.Ъ, источник азота и необходимые соли в условиях аэрации.

Культивирование ведут при температуре среды 15-41оС, преппочтитель786916 но 35-37 С и рН в пределах 5,3-9,1, предпочтительно 6,3-7.

Скорость роста бактерий снижается постепенно, если концентрация метанола превышает 4 об.Ъ. Метанол по мере увеличения размера колонии бакте рий, в случае необходимости, добав- ляют в течение всего времени выращивания.

Скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с

40 л/20 л/мин до 60 л/20 л/мин . Культивирование микроорганизмов осуществляют также с постоянной скоростью аэрации среды, равной 10 л/20 л/мин или 20 л/20л/мин, или 40 л/20 л/мин, или 60 л/20 л/мин, или 80 л/20 л/мин, или 100 л/20 л/мин.

Максимальное количество бактериальных клеток получают примерно через 48 ч после начала выращивания.

Содержание грубого протеина в бактериальных клетках может быть рав. ным, примерно 803.

Бактериальные клетки имеют высокую питательную ценность, не токсичны и обеспечивают получение источника протеина, добавляемого н корм и пищу.

Используемый штамм Methylomonas

probus FERN-РР 3193 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Форма и размер клеток: 1 или 2 до 3 цепная бацилла с размерами

0,5-0,7 1,0-1,5 мкм, клетки не обладают полиморфизмом, переднигаются при помощи единственного полярного жгутика, споры отсутствуют,, результат скрашивания по способу Грэма отрицательный.

Ю

Морфологические свойства исследуют на клетках, выращенных в синтетической среде неорганических солей при 30оС в течение 24-48 ч, содержащей, г (N Hq ) НР0,, 3, 5; КН РО

1, 5; Kg HP04 1, 5; М950 4 ° 7Н О О, 3;

СаС1 2Н О 0,01; Ге504 7Н О 0,01; метанол 2 об.%, вода 1 л.

Штамм не обладает устойчивостью относительно кислоты.

Условия роста.

На агаровой пластинке с культурой в синтетической среде неорганических солей бактерии быстро размножаются и образуют ровные, сплошные и выпуклые круглые колонии.Колонии полупрозрачные с блеском сероватого, белого или розового цвета.

На скошенном arape с культурой в синтетической среде неорганических солей рост бактерий наблюдается во всей среде. Колонии имеют нитевидную Форму с блеском сероватого, белого или розового цвета. Смешанной окраски не наблюдается.

В чашке с бульонным агаром нет признаков роста или слабый рост.

Колония имеет размеры менее 0,5 мм. после нырашинания 48 час при 30 С.

Колония имеет ровную, круглую форму, блеск и прозрачность.

На буЛьонном скошенном агаре нет признаков роста или слабый рост. В последнем случае колония имеет нитевидную Форму и прозрачность.

На бульонной жидкости нет никаких признакон роста.

На насыщенном желатиноном бульоне . нет никаких признаков роста, и желатина не разжижается.

На лакмусовом молоке не наблюдает ся никаких изменений. Добавление 1% метанола не производит никаких изменений.

Физиологические свойства.

Нитраты восстанавливает. Индол не образует.

Сернистый водород не образует,крахмал не гидролизует, лимонную кислоту не использует. Образование пигмента: образует небольшое количество желтого пигмента, растворимого в воде, в синтетической жидкой среде неорганических солей. Бактериальные клетки серовато-розоные.

Использование источников азота. хлорид, сульфат, нитрат аммония, первичный и вторичный Фосфат аммония, мочевина, карбонат аммония и полиМочевину образует. Окисляется, катализ положительный.

Условия роста: рН 5,3-9,1, предпочтительно 6.3-7,0.

Температура 15-41 С, предпочтительно 35-37оС.

Отношение к кислороду — аэроб.

Образование газа и кислоты не наблюдается по способу Хью Лейфсона.

Пара-оксибензоат не использует.

Лммоний не образует.

Ферментации сахаров (при наблюдении в течение 30 дней раствора пептона с добавлением 1% сахаров: L-арабиноэа Д-ксилоза > Д-глюкоза, Д-манноза, д-фруктоэа, д-галактоза, мальтоза; сукроза, лактоза, треалоза, L-рамноза, маннит, сорбит, глицерин, 5р крахмал) не образует.

Пример 1. Компоненты растворяют в 1 л ионообменной воды в количестве, г: (NH4) НР04 3; KHgPOq . 1,5; К2НРО 1,5; 11gSO4 7Н О 0,5;

Ге504. 7Н О 0,1, получая раствор с рН 7,0.

Затем по 100 мл этого раствора помеща .зт в несколько колб, емкостью

300 мл, а после стерилизации в каждую колбу добавляют 1,6 r метанола, получая среду для выращивания бактерий Иеййу!оаопаь probus FERM-P

Р 3193, которые до этого выращивают на среде со скошенным агаром.

Процесс ведут при взбалтывании культуры в. течение двух дней при

gg пептон в неорганических питательных растворах. Используют нитрат, нитрит, метиламин и экстракт дрожжей.

786916

30 С. Затем клетки отделяют в сепара торе, промывают ионообменной водой и сушат при 110 С до стабилизации веса, получая 7,2 r сухих клеток на

11 л культуральной жидкости.

Выход составляет 45,0% в пересчете на добавленный метанол.

Пример 2. 200 мл метанола

1 % (объем/объем) вводят в ферментер емкостью 30 л, содержащий 20 л раствора при рН 7,0 следующего состава, r: (NH4)< НРО 4,0; КН2РО4 1,0;

К НР04 1,0; MgSO4 7Н О 0,5И Ге504к 7Н О 0,1 в 1 л йонообменной воды.

Раствор стерилизуют и в эту среду засевают 2% (объем/объем) бактерий

Methylomonas probus ГЕКИ-Р 1. - 3193> которые до этого выращивают н той

me среде.

Процесс ведут при перемешинании со скоростью 500 об/мин, 35 С и аэрации со скоростьв 30 л/20 л/мин (1,5 объем/объем/мин) в течение

48 ч, при этом скоростью аэрации увеличивают постоянно до 40 л/

/20 л/мин, 2,0 объем/объем/мин/ и далее до 50ë/20 л/мин/ 2,5 объем/объем/мин и до 60 л/20 л/мин (3,0 объем/

/объем,мин.).В течение процесса выращивания рН поддерживают автоматически на уровне от 6,6 до 7,2 добавлением 14% аммиачной воды. Содержание метанола поддерживают автоматически так, что его потребление составляет от 0,3 до 1,0%, а контроль осуществляют при помощи газовой хроматографии.

Затем клетки отделяют в центробежном сепараторе, промывают ионообменной водой и сушат при 110 С до стабилизации веса.

Выход сухих бактериальных клеток составляет 25,0 г/л через 28 часов после начала выращивания, 40,7 г/л через 40 часов и 53,8 г/л — через

48 часов.

Пример 3. Готовят смесь при следующем содержании КОМНОНеНтон, г: (ЙН4) НРА4 4; (NH4) >SO< 0 8;

КН РО4 1, 0; К НР04 1,0; Mg SO 7 Î

О, 7; Ип 504 4-6 Н20 О, 01; Cu SO ° 5F120

О, 01; СоС1 б Н О О, 01; Fe SO+ ° 78<0

0 1; Znso 7H2O 0 01 а 12 2HZO 0,01; (NH4)6 No 4 4 4Н О 0,01 компоненты растноряют в иойообменной воде, получая 1 л смеси.

20 л указанной смеси подают в 30л ферментер, стерилизуют при 120оС

15 минут, добавляют 2% /объем/объей метанола и получают среду для выращивания культуры, в последнюю засевают раствор культуры Methylomonas

probus FERM-P Р 3193, которую предварительно выращивают 18 ч н среде того же состава (содержание метанола 1,0% (объем/объем) и 2,0% (объем/

/объем3. . Культуру выращивают 28 ч при 37 С и перемешивании со скоростью 500 об/мин при скорости аэрации, 65

Непрерывный процесс выращивания проводят при услониях наиболее высокой продуктивности 8,1 г/л в течение всего процесса.

Пример 5. Бактерии того же штамма, как н примере 3, выращивают при таких же условиях при непрерывном процессе при скорости аэрации

30 л/20 л/мин 11,5 объем/объем1мин рН среды поддерживают 6,6-7,2 с добавлением 1% аммиачной воды. Кон-. центрацию метанола в среде выращива. ния контролируют при помощи газовой хроматографии. Иетанол непрерывно добавляют микронасосом так, что его концентрация остается на уровне

0,3-2,0% (объем/объем f в течение всего процесса выращивания. Общее добавляемое количество метанола до занершения процесса выращивания составляет 1,035 г.

Бактериальные клетки выделяют в центробежном сепараторе при 110 С до стабилизации веса, получая 25,6 r сухих клеток на 1 л культуральной жидкости, что соответствует производительности 49,5% в пересчете на добавленный метанол.

Содержание грубого протеина соста20 вляет 80,3%.

Скорость роста бактерий определя. ют при помощи измерения помутнения раствора для выращивания культуры колориметром.

25 максимальная удельная скорость роста составляет 0,82 ч", а время образования 51 мин.

Пример 4. Бактерии того же . штамма, как в предыдущих примерах, выращивают при помощи циклического процесса при условиях, как и примере 3. Так как концентрация растворенного кислорода в растворе для выращивания культуры уменьшается с ростом клеток,.скорость аэрации среды нозрастает до 40л/20 л/мин (2,0 объем/

/объем/мин), затем до 50 л/20 л/мин (2,5 объем/объем/мин) и наконец до

60 л/20 л/мин (3,0 объем/объем/мин), последовательно и в момент, когда

40 концентрация клеток в растворе достигает 43,6 г/л. Выращивание, как процесс периодического действия, переключается на "непрерывное" выращивание при помощи непрерывной пода45 чи среды, аналогичной той, которую используют при "периодическом" выращивании, в раствор со скоростьв разбавления 0,28 ч- . Одновременно из ферментера удаляют равное количество культуральной жидкости, рН среды под. ,держинают на уровне 6,6-7,2-добавлением 14% аммиачной воды, концентрацию метанола в процессе ныращиНания поддерживают на уровне от 0,3 до 1,0%

fîáúåì/oáúåì), а контроль осуществляют при помощи газовой хроматографии.

786916

Контрольная груп-; па

4, 20+

0,41

59,9+3,0, 175,2

16,6

115,3+

17,0

484,8

Группа Х 60,1+3,1

115,4

14,9

466,1

175,5+

14,5

4,04+

0,34

116,5+

15,4

4,01+

0,31

467,2

Группа д 59,8 3,0

176,3+

15,5

Формула изобретения 30 л/20 л/мин (1,5 объем/объем/мин).

Продуктивность составляет до 4,2 г/л.

Пример 6. Выращивание проводят, как в примере 3 того же штамма, непрерывно при тех же условиях, при скорости аэрации 40 л/20 л/мин (2,0 объем/объем/мин). Продуктивность составляет 5,6 г/л ч.

Пример 7. Выращивание проводят, как в примере 3, непрерывно, при скорости аэрации 50 л/20 л/мин (2,5 объем/объем/мин). Продуктивность составляет 7,3 г/л ч

Пример 8. Выращивание проводят при тех же условиях с использованием того же штамма, как описано 35 в примере 3, непрерывно, при скорости аэрации 60 л/20 л/мин (3,0 объем/

/объем/мин). Продуктивность составляет 8,1 г/л ч

Пример 9. Непрерывное выра- Щ щивание проводят при скорости аэрации 80 л/20 л/мин (4,0 объем/объем/

/мин) при тех же условиях, с использованием того же штамма, как в примере 3. Продуктивность составляет

9,3 г/л ч

Пример 10. Непрерывное выращивание проводят при скорости аэра. ции 100 л/20 л/мин (5 объем/объем/

/мин) при тех же условиях с использованием того же штамма, как в при- З® мере 3. Продуктивность составляет

12,2 г/л.ч.

Результаты испытаний показывают, что различие в увеличении веса живот ных, а также.в потреблении пищи незначительное.

Внешне по блеску шерсти и подвижности животные групп I, II и контроль- 40 ной группы не различаются.

Проверка внутренних органов всех групп при помощи вскрытия не обнаруживает каких-либо отклонений от нормального состояния ° 65

Пример 11. Проводят испытание, связанное с кормлением самцов крыс при использовании клеток

Methylomonas probus ГЕКИ-Р Р 3193, выращенных в соответствии с описанными примерами.

Испытание проводят на 60 крысах

Вистера (возраст 3 недели) с применениегл основного корма, следующего состава, Ъ : казеин (без витаминов)

12,0; сахар 5,0; масло соевых бобов

6,0; витамин группы В 0,3; пшеничный крахмал 61,0; порошок целлюлозы

11,5; витамины А и 0 0,2; минеральные вещества 4,0, кроме того йа 5еО

0,2 r. После кормления крыс основным кормом в течение 5 дней их разделяют на 3 группы по 20 в каждой. Крысам первой группы продолжают давать непрерывно основной корм и используют в качестве контроля, а две другие группы подвергают испытанию и группе 1 дают в пищу основной корм без

12% витаминного казеина с добавлением 20% сухих бактериальных клеток по изобретению, а группа П вЂ” основной корм без 16% витаминного казеина с добавлением 10% сухих бактериальных клеток.

Крысы трех групп получают корм указанного состава 5 недель. Одновременно фиксируют вес животных и количество потребляемого корма.

Данные испытания приведены в таблице.

Таким образом, полученная биомасса имеет высокое качество и может быть использована в качестве источника протеина в кормах животных.

1. Способ получения биомассы путем культивирования микроорганизмов-бакуерий рода Methylomonas—

786916

10!

Составитель A.Бражникова

Редактор С.Титова Техред Т.Маточка -, Корректор М.Демчик

Заказ 8892/66 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, источник азота и необходимые соли в условиях аэрации с последующим выделением биомассы одним иэ известных способов, о т л и ч а ю ui и и с я тем, что, с целью говышения содержания белка в биомассе и возможности ее использования в качестве пищевой добавки, иэ рода бактерий Methylomonas используют штамм Methylomanas

probus FERM-P Р 3193, при этом культивирование ведут при температуре среды 35-37 С и рН 6,3-7.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что концентрация метанола в питательной среде составляет до 4 об.Ъ.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с 40 л/20 л/мин до

60 л/20 л мин.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что культивирования микроорганизмов осуществляют с постоянной скоростью аэрации среды равной 10 л/20 л/мин или 20 л/

/20 л/мин или 40 л/20 л/мин или

60 л/20 л/мин или 80 л/20 л/мин или

100 л/20 л/мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

15 1. Патент Великобритании

Р 1420264, кл. С 6 F, опублик.1976.