Способ получения антибиотика к 582 м
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
<«1 786915 Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительный к патенту (53)М. Кл з
{22) Заявлено 28. 12. 78 (21} 2704455/28-13
С 12 0 9/00 (23) Приоритет — (32) 28.12 77 (31) 52-157416 (33) Япония
Государственный комитет
СССР но делам изобретений и открытий
Опубликовано 07.1280. Бюллетень М 45
Дата опубликования описания 0712.80 (53) УДК 615.779..90 (088.8) Иностранец
Сигедзи Хондо (Япония) (72) Автор изобретения
Иностранная фирма
"Какеньяку Како Ко., ЛТД" (Япония) 4. (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА К 582 М
Изобретение относится к области микробиологии, к получению антибиотиков
Предложенный антибиотик новый и способ его попучения в патентной и научно-технической литературе не описан.
Целью изобретения является получение нового антибиотика К 582 М.
Эта цель достигается тем; что штамм Metarhizium anisopliàå (Metsch) Sorok Var an1sopliae 582 М выращивают в аэробных условиях в жидкой питательной среде при 20-37 С о .и рН 3,0-8,0 с последующим выделе- 15 нием целевого продукта.
Штамм Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok Var.anisopli àå 582 И, продуцирувщий антибиотик, депонирован в коллекции (банк вирусов) ве- 20 домства Японии (KogyogijutsuinВi seibutsn-Kogyo - lejutsu 1Ken Kyujo) и зарегистрирован под номером
FE R М-Р 9 4217 и под номером ATCC
Р 20500. 25
Культурально-морфологические признаки. Колонии на солодовом агаре достигают диаметра 4;5-5,0 см за две недели при 25оС, имеют форму пучка или снопа. Колонии плоские или в 30
2 некоторых случаях радиально вдавленные,. цвет колонии от темно-сероватозеленого до желтовато-зеленого и белого по краям.
Обратная сторона колонии от желтого до кремового цвета.
1Рицелий бесцветный, имеет перегородки и ответвления; конидиофоры короткие, бесцветные и имеют перегородки, мицелий мелкоразветвленной формы, затем образует массу тесно скомпонованных гирлянд. Гирлянда имеет цилиндрическую форму, бесцветная, концы тонкие с длинными цепями конидий.
Конидий представляют собой одноклеточные плоские героспоры бледного желтовато-зеленого цвета, которые имеют цилиндрическую или удлиненную эллипсоидную форму и черыте закругленных угла. Длина и ширина конидии составляет 4,0-8,0 и 2,0-2,5 мкм соответственно.
Агар Чапека: рост хороший, форма подушки, край ресничный, образует споры от желтовато-зеленого до темно-зеленого цвета, пигменг продуцирует.
Агар Докса-Чапека: рост хороший, форма пуговицы, споры от желтовато786915 зеленого до темно-зеленого цвета, пигмент продуцирует. Arap Сабуро: рост хороший, Аорма подушки, образу-. т споры от желтовато-зеленого до темно-зеленого цвета. Пигмент отсутствует.
Arap на отваре из кукур зной муки: рост плохой, край в Аорме зубцов в нерегулярном наборе, образует споры темно-зеленого цвета. Пигмент отсутствует. !О
Солодовый агар: рост довольно плохой. Мицелий представляет собой тонкую плоскую структуру, край волнообразный, опоры от серовато-зеленого до темно-зеленого цвета. Пигмент продуцирует. Картофельный агар с декстрозой: рост довольно плохой, мицелий тонкий и плоский, край ресничный. Образует .споры темно-зеленого цвета. Пигмент продуцирует.
Желатиновый агар: рост довольно плохой, мицелий тонкий и плоский, край волнообразный, споры темно-зеленого цвета. Пигмента нет.
Обычный агар: рост плохой. Иицелий имеет Аорму тяжелых снежных 25 хлопьев, край волнообразный. Спор нет, пигмента не образует.
В качестве среды для культивирования используют различные питательные вещества. ЗО
В качестве источников углерода используют различные сахара, такие как декстроза, сахароза, левулеза (Аруктоза), манноза, глицерин, различные сорта крахмала, мальтозу, 35 ксилозу, лактозу, мелассу, маннан.
В качестве источников азота используют различные неорганические соли, такие как нитрат натрия, нитрат аммония, хлористый аммоний, а также органические азотистые вещества, такие как питательный бульон, пептон, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, осевая мука, мука земляного opexà (арахиса.), аминокислоты. При необходимости исполь- фЯ зуют подходящие неорганические соли и вспомогательные вещества.
Культивирование предпочтительно осуществлять в жидкой среде.
Культивирование проводят в аэроб- Щ ных условиях при 20-37, предпочтительно 28-30 С при рН 3,0-8,0, предпочтительно рН 5,4-5,6.
При необходимости в среду добавляют пеногаситель.
После завершения ферментации выделяют продукт Аерментации путем осаждения гидроАильным органическим растворителем, таким как этанол, ацетон, органической кислотой, например пикриновой, Флавиановой, АосАо- бО вольАрамовой кислотой, пентахлорфенолятом натрия, бензальдегидом, экстракцией метанолом или активными адсорбентами различного типа. А также используют способ очистки, ос- 6S
К 582 М-В (солянокислая соль) 39,35
36,25
7,24
6,61
18,03
14,83
18,62
14,06
В табл.2 приведен молекулярный вес указанных продуктов, измеренный тремя описанными ниже методами; однованный на применении ионообменных носителей, хроматографии на молекулярных ситах, способа плотности ориентации, метода противоточного распределения, способа Аракционирования солями, растворителями или ионами металлов, метода электрофореэа в различных его вариантах, способа выделения путем образования комплексного вещества.
Целевой продукт может быть выделен из культуральной среды с помощью осаждения с очисткой ионообменными смолами. Способ включает стадии фильтрования культуральной среды с применением фильтрующих средств, обработки фильтрата катионообменной смолой в кислой среде или основным ионообменником и последующего элюирования целевого продукта кислотой или щелочью.
Полученный таким образом концентрат дополнительно концентрируют ионообменной смолой, после чего к нему прибавляют соответствующие количества этанола и ацетона.
В результате получают сырую порошкообразную смесь К 582 М-А и
К 582 М-В.
Полученный сырой порошок обрабатывают затем метанолом, окисью алюминия, активированным углем и проводят хроматографирование с помощью молекулярных сит, в результате чего получают очищенный продукт.Полученный очищенный продукт может быть в дальнейшем подвергнут обработке различными хроматограАическими методами с использованием таких сорбентов и носителей, как полиакриламидный гель, карбоксиметил (СМ)-сефадекс, с целью выделения индивидуальных продуктов К 582 И-A и К 582 М-В.
В табл.1 приведены физико-химические свойства полученных продуктов К 582 M-A и К 582 M-В.
Т а б л и ц а 1
786915
Таблица 3
0,4
0,2
Candida
àI Û cans
Candida
trop са1is
0,4
0,2
Гель-фильтрация
1200
1300
0,4
Candida utilis 0,2
Криоскопический
0,4
1220
1300
Candida
quilliermondii
Изопиестичес кий
0,4
0,2
1200
200
Candida Kr.usei
0,4
0,2
Saccharomyces
cerevislae
Br.= 60
Удельное оптическое вращение (сД2 =+0,2, (С=1%, Н О ) и А3 =+0,6 (С=13, Нд О); т. пл. (с разложенйем) 30
192-198 и 197-203 С для продуктов
К 582 М-А и К 582 M-В.
К 582 M-А (солянокислая соль хорошо растворима в воде, метаноле.
Умеренно растворима в этаноле, не- 35 растворима в диэтиловом эфире, петролейном эфире, бутаноле, хлороформе .и бензоле. Такая же растворимость и
К 582 N-В. Сульфаты К 582 М-А и
К 582 М-В хорошо растворимы в воде, умеренно в метаноле, нерастворимы во всех прочих растворителях.
Цветные реакции К 582 M-A u К 582 M-В.
0,4
0,2
0,4
0,4
0,2
Иi 11 i à anomal a
0,4
Toru1aspora
deibrucki i.
0;4
0,2
Rhodotoruler
-E up ra
0,2
0,4
Нингидриновая реакция: положительная (+) .
Ксантопротеиновая реадпия ;(+)
Реакция Миллона: (+)
Реакция Сакагучи: (+)
Реакция Паули: (+) 50
Реакция Малиша: отрицательная (-)
Реакция Толлена-Орсина: (-)
Реакция с нитропруссидом натрия (-) °
К 582 М-А 582 М- — белые аморфные порошки.
0,2
Hycotorula
Debaryomyces
Kloecheri
0,4, 0,2
Pul1ulariа
pullulans
0,4
0,2
P roteus ОК=19
20
Staphylococcus
aureus 209-P
> 100
>100
Baci l i us
sUbtilis
> 100
Стабильны в кислых и нейтральных средах, нестабильны в щелочных средах.
>100
>100.
> 100
Sarcina Lutea
á5 Rata
>100
>100 нако поскольку эти методы дают значительную погрешность в указанном ниже диапазоне молекулярных весов, характеристики веществ не ограничиваются измеренными таким образом значениями молекулярного веса.
Таблица 2
Актибиотическ ая иктивность
К 582 М-.А и К 582 М-В, определенная методом разбавления, приведена в .табл.3.
Candida
pseudbtropiса1is 0,2
Saccharomyces
rouxii bottlucue 0,2
Lygosacchегоmyces
saEsus 0, ЕзсЬег(сЬ1а col i >100
Shiде11а sonne i >100
786915
Bac I l l us
mycoides
) 100
> 100, Mycobacterlum
cynote
>1000 > 10 00
Mycobacterium
Smegmatis
)1000 ) 1000
Mycobacterium
Н.у КЧ
>1000 > 1000
Trichohyton
astегоides.>1000 > 1000
Tr.i chohyton
Lpulam
) 1000 > 1000
Trlchomonas
Maginalis
>1000 > 1000
50
100
AH 44
АН 66
80
24,1-34,8
Внутривенное.М 120-144
Внутрибрюшинное
43,2-57,2
М Свыше
300
43,2-57,2
Ж Свыше
300
86,8-104
Подкожное
М 320 или более
Ж 320 или более
104-125
Йероральное
2400-.3000
М Свыше
6000
2400-3000
Ж Свыше
6000
Продолжение табл, 3 (Как видно из данных, приведенных в табл.3, К 582 М-А и К 582 М-B проявляют высокую антибиотическую активность против микроорганизмов рода Candida и других дрожжей.
Данные, характеризующие острую токсичность продуктов К 582 М-A u
К 582 М-В, приведены в табл.4.
1 Таблица 4
Ж 144-1728 24,1-34,8
Активность К 582 M-А и К 582 M-В в ингибировании роста раковых опухолей. Противоопухолевое действие укаэанных веществ испытывалось на крысах, являющихся носителями раковых клеток.
Нескольким группам крыс, каждая из которых состояла из десяти крыс линии Донриу (самки весом 150- 200 r) трансплантировали по 10 асцитных клеток рака печени AH 44 и AH 66, соответственно, причем пересадку клеток производили в хвостовую вену животных. По прошествии 72 ч подопытным крысам вводили перорально препараты
К 582 _#_-А или К 582 М-В в дозе
30 мг/кг непрерывно в течение 10 дней, после чего крысы находились под наблюдением в течение 60 дней.
Затем определяли процент выживаемости крыс, участвовавших в эксперименте. Как видно из данных, приведен- . ных в табл.5, при использовании укаэанных препаратов в каждой группе крыс, которым предварительно пересаживали раковые клетки, отчетливо проявлялся эффект ингибирования
tïîäàâëåíèÿ) опухолевых клеток, особенно наглядный при сравнении с вы° живаемостью в контроле, где крысы после пересадки опухоли получали только кормовую диету. таблица 5
В результате различных эксперймен.тов обнаружено,что продукты К 582 M-A и К 582 М В способны оказывать влияние на иммунитет живых организмов (как гуморальный, так и клеточный). Вещества обладают как ускоряющим, так и тормозящим (ингибирующим) действием на иммунную систему, что .было показано гемолизиновым титровальным методом при введении 30 эритроцитов овцы.
Нескольким группам мышей, каждая из которых состояла.из 5-10 самок линии ddl,ââîäèëè внутрибрюшинно препаюат К 582 M-. Â в дозе 25 мг/кг и в дозе 2,5 мг/кг в течение 4 дней, затем в хвостовые вены мышей трансплантировали каждой 4 ° 10 эритроцитов овцы и введение К 582 M-В продолжали еще в течение 4 дней. После завершения, этой процедуры производи786915 ли измерение уровня антител в крови.
Группа мышей, которым вводили по
25 мг/кг препарата К 582 М-В, показала содержание антител в крови на уровне 77% в расчете на аналогичную величину у контрольной группы, тогда как группа мышей, которым вводили
2,5 мг/кг, показала средний уровень антител в крови порядка 234%, считая на содержание антител в крови животных контрольной группы. Группы мышей, которые получали более высокие концентрации прй введении указанного препарата, продемонстрировали тенденцию к ингибированию иммунитета, тогда как. группы, получавшие более низкие концентрации препарата 35
К 582 И-В, продемонстрировали тенденцию к акселерации иммунитета.
Было обнаружено, что при введении препаратов К 582 М-А и К 582 И-В в живой организм наблюдается повышение Я уровня индуцирования интерФерона в крови.
Пример 1 ° а) 200 мл культура-, льной среды (рН около 6), имеющей состав,%: 3,0 глюкозы,1,0 полипептона, 0,2 нитрата. натрия,0,1 дигидрофосфата калия, 0,05 хлористого калия, 0,05 сульфата магния, 0,01 сульФата двухвалентного железа, инокулируют куль,турой Metarhi zium anisopliae (Metsch),3
Sorok.Var.anisopliae 582 М (штамм
Bikoken FERM-P 4217, ATCC 9 20500) и проводят культивацию в условиях встряхивания при температуре 30©С в течение 14-20 дней. б) Процедуру примера 1а) повторяют, но вместо 1,0% полипептона в культуральную.среду добавляют 0Ä1% смеси аминокислот (глицина, аспарагина, аргинина, гистидина, аланина и некоторых других, которые добавля- 4р ют отдельно1.
Пример 2. 5 л фильтрата культурального бульйона,полученного в примере 1, Фильтруют с добавлением гифло-суперцеля (средства, представ- 43 ляющего собой очищенную диатомитовую землю).
После доведения величины рН до
6,0-7,0 полученный Фильтрат пропускают через колонку, имеющую внутрен- Я) ний диаметр 20 и высоту 500 мм.и заполненную ионообменной смолой
JPC-50 в смешанной водородно-натровой форме (Н Ма ) с целью поглощения целевых веществ из культурально- у
ro бульона. Колонку промывают водой и затем пропускают через нее 500 мл
1,0 н. раствора соляной кислоты со скоростью 10 мл/мин для элюирования целевых веществ. Величину рН элюата доводят до 6,0 и нейтрализованный та- еО ким образом элюат концентрируют в вакууме. Полученный концентрат оставо ляют на.ночь при температуре 35 С с добавлением пентахлорфенолята натрия с тем, чтобы вызвать осаждение 65 пентахлорфенолята смеси К 582 И-A u
К 582 М-В. Полученный осадок пентахлорфенолята смеси К 582 М-А и
К 582 N-В промывают всдой, затем растворяют в бутилацетате и полученный раствор дважды экстрагируют в делительной воронке разбавленным раствором соляной кислоты, имеющим рН 2,0-3,0 с целью получения водного раствора смеси солянокислых солей (гидрохлоридов ) К 582 М-А и К 582 И-В.
Этот водный раствор промывают несколько раз бутилацетатом, водный слой доводят до рН 4,0 и затем концентрируют при пониженном давлении.
К остатку прибавляют количество этанола, достаточное для осаждения смеси солянокислых солей К 582 И-A и К 582 И-В. Таким образом получают 5,0 r сырого порошка, представляющего.собой смесь солянокислых солей К 582 И-A и К 582 M-В.
Полученный порошок снова растворяют в метаноле и, прибавляя к метанольному раствору достаточное количество ацетона и этанола, производят осаждение смеси солянокислых солей К 582 М-A и К 582 И-В, которую отделяют Фильтрованием. Полученную таким образом смесь К 582 M-A u
К 582 И-В (в виде солянокислых солей) растворяют в метаноле и очищают пропусканием через колонку с сеФадексом LH-20, в результате чего
;получают 4,0 г смеси К 582 И-A u
К 582 М-В (в виде солянокислых со- . лей), представляющей собой белое порошкообразное. вещество.
Приме р 3. 1 г смеси солянокислых солей К 582 И-А и К 582 И-В,, полученной в соответствии с процедурой, описанной в примере 2, растворяют в 5 мл воды и водный раствор обрабатывают хроматографически, используя колонку (внутренний диаметр
26, высота 1200 мм) с биогелем P-2, имеющим размер частиц 100-200 меш.
Используя.в качестве элюата 0,1 M .. водный раствор хлористого натрия и проводя элюацию со скоростью.30 мл/ч, получают на выходе из колонки сначала Фракцию К 582 M-В (тоже в виде солянокислой соли). Полученные таким образом элюаты A и В снова хроматографируют и после повторного выхода из колонки концентрируют при пониженном давлении. К полученным в остатке веществам прибавляют для осаждения смесь ацетона и этанола (4:1) и после высушивания полученные осадки повторно экстрагируют метанолом.Иетанольный раствор концентрируют в вакууме и остаток дифундируют добавлением смеси ацетона и этанола . (4. 1). После высушивания полученных осадков получают в виде порошкообразных продуктов К 582 И-А (солянокислую соль) или К 582 И-В (солянокислую соль). Затем каждый из полу786915
12 ченных порошков A и В растворяют в небольшом количестве 80Â-ного метанола и полученные метанольные растворы очищают хроматографически с использованием колонки (внутренний диаметр 26, высота 1200 мм), заполненной сефадексом LH-20. Полученные элюаты концентрируют при пониженном давлении и вещества, содержащиеся н остатках после упаринания, осаждают смесью ацетона и этанола (4:1).
После высушинания полученных осадкон до постоянного веса получают
0,41 r К 582 И-A в виде солянокислой соли (выход 41,0%) и 0,35 r К 582 И-В тоже в виде солянокислой соли (выход 35,0Ъ).
Пример 4. 1 г смеси солянокислых солей К 582 И-А и К 582 N-В, полученной н соответстнии с примером 2,растворяют в -5 мл воды и этот водный растнор хроматографируют, используй колонку (ннутренний диаметр
20, высота 500 мм) с карбоксиметилсефадексом С-25 (100-200 меш). Хроматографию проводят при использовании н качестве элюатов сначала
0,1 И буферного раствора фосФорной кислоты (рН 6}, затем 0,4 М раствора хлористого натрия и в заключение
0,9 И раствора хлористого натрия.
После изменения элюата на 0,9 И раствор NaCl сначала из колонки элюируется К 582 И-А (н виде соля.нокислой соли},а затем К 582 И-Ц (тоже н виде соляной соли). Элюаты
К 582 И-A (солянокислая соль) и
К 582 И-В (солянокислая соль)концентрируют, высушивают, повторно экстрагируют метанолом и полученные метанольные растворы сначала концентрируют в вакууме до образования небольшого по объему остатка, а затем этот остаток обрабатывают смесью ацетона и этанола (4: 1) с целью, по. лучения соответственно K 582 N A (солянокислой соли) и К 582 И-В (тоже солянокислой соли). Каждый из полученных таким образом порошков растноряют н небольшом количес- тве 80Ъ-ного метанола и этот метанольный раствор очищают обессолива-, нием с помощью хроматографии на колонке с сефадексом LH-20. После концентрирования соотнетствующих элюатов при пониженном давлении ве- щества, содержащиеся,н остатках, осаждают прибавлеНием смеси ацето-. на и этанола (4:1). После высушивания осадков получают соответственно
0,40 г очищенного К 582 N-A (соля- нокислой соли) (выход 40,0oo) и
0,43 r очищенного К 582 N-В (солянокислой соли) (выход 43,0Ъ).
Пример 5. 5 л культуральной среды, полученной в соответствии с примером 1, фильтруют с добавлением
10 г гифло-суперцеля. Полученный фильтрат доводят до рН 5,0-6,0, концентрируют до объема, составляющего
1/10 — 1/20 от первоначального объема, удаляют содержащиеся н концентрате неорганические соли, снова упаривают (на этот раз досуха) и полученный остаток экстрагируют несколькими порциями метанола общим объемом 200 мл.Объединенный экстракт концентрируют в вакууме и остаток повторно экстрагируют метанолом, используя для этой цели последовательно уменьшающиеся количества метанола. Полученные экстракты полностью растворяют в воде и этот водный раствор хроматограФируют на колонке (внутренний диаметр 50, высота
15 1000 мм) с биогелем Р-2 (100-200 меш.
При использовании в качестве элюента 0,1 И раствора хлористого натрия, пропускаемого через упомянутую колонку со скорость.о 30 мл/ч, сначала
20 получают Фракцию К 582 N-А (солянокислую соль), а затем фракцию
К 582 М-В (солянокислую соль). Злюаты, соответствующие этим Фракциям, очищают каждый путем обессоливания в соответствии с процедурой, описанной в примере 3 (экстракция метанолом, прибавление смеси ацетона и этанола, хроматография на колонке с сефадексом LH-20), в результате чего получают 1;4 г высушенного
К 582 И-A (солянокислую соль) и
1,2 r высушенного К 582 N-В (солянокислую соль), соответственно.
Пример 6. 5 л культуральной среды, полученной в соответствии с примером 1, фильтруют с добавлением фильтрующего средства гиФло-суперцель. После концентрирования в вакууме фильтрат отделяют от выделившихся твердых веществ Фильтрованием, 40 доводят его рН до величины порядка
5,0-7,0 и затем пропускают через колонку (внутренний диаметр 20, высота 1000 мм) с CN-сефадексом С-25 (100-200 меш.) с целью поглощения
Я целевых веществ. Затем адсорбированные вещества элюируют с колонки снайала 0,1 N буферным раствором ФосФор ной кислоты, имеющим рН 6,0, затем
0,4 И раствором хлористого натрия у и в дальнейшем 0,9 N раствором NaC1.
После замены элюирующег9 раствора на 0,9. И раствор хлористого натрия из колонки выходит сначала Фракция
К 582 М-A (солянокислая соль),а за55 тем фракция К 582 М-В (тоже в виде солянокислой соли) .Эти разделенные на фракции элюаты,один из которых содержит солянокислую соль К 582 И-A а другой солянокислую соль К 582 И-B концентрируют в вакууме,обессоливают
40 с помощью метода, описанного н примере 4 (метанольная экстракция, добавление смеси ацетона и зтанола, хроматография на колонке с сефадексом
LH-2О), высушивают и получают в ито65 ге 1,2 г„ высушенного К 582 N-A
786915
Составитель С.Малютина
Редактор Е.Корина Техред Т.Маточка Корректор М.Демчик
Заказ 8892/66 Тираж. 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, -35, Раушская наб., д.4/5
Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðî, ул.Проектная,4 (его солянокислой соли) и 1,3 r высушенного К 582 М-В (солянокислой соли) соответственно.
Пример 7. 2 r гидрохлорида
К 582 М-А, полученного по методу, описанному в примере 3 илй «4, растворяют в 5 мл дистиллированной воды и раствор наносят на колонку со слоббкислотным катионитом.Амберлит
IRC-50 (4.25 см). После промывки колонки 400 мл дистиллированной воды
K 582 М-А (сульфат) элюируют 1н.раствором серной кислоты. Элюат, содержащий К 582 И-А в виде сульфата,,обрабатывают ионитом IPA-400. После доведения рН смеси до 6,0 смолу отфильтровывают и фнльтрат концентрируют в вакууме. К этому концентрату прибавляют смесь ацетона и этанола (4:1) и выпавший осадок отделяют фильтрованием. Полученный К 582 М-A (сульфат) хроматографируют с целью обесаоливания и очистки на колонке с се@алексом LH-20 (колонка 2,2 м 80 см) Для элюирования вещества из колонки используют дистиллированную воду.
Предложенный способ позволяет по лучить новый антибиотик К 582 М.
1О формула изобретения
Способ получения антибиотика
К 582 М, отличающийся тем, что штамм Metarhizlum anisopllae (Metsch) Sorok. Var. anisopliae 582 М
3$ выращивают в аэробных условиях в жидкой питательной среде при 20-37 С и рН 3,0-8,0 с последующим выделением целевого продукта.
