Способ выделения ацетоина

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

i F11777059

Союз Советских

Социалистических республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 06.12.78 (21) 2704275/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Ka.

С 12D 13/00

Государственный комитет

СССР (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.11.80. Бюллетень № 41 (45) Дата опубликования описания 07.11.80 (53) УДК 663,11 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

И. Б. Романова, Т. М. Филиппова, Т. Б. Казанская и Ю. Г. Анюхина

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЪ|ДЕЛЕНИЯ АЦЕТОИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения ацетоина из культуральной жидкости микроорганизмов — продуцентов.

Ацетоин — СНзСОСНОНСНв (3-окси-2бутанон, ацетилметилкарбинол) наряду с продуктом его окисления диацетилом является важным ароматическим фактором ряда пищевых продуктов, влияющим на их качество. Он встречается в хлебе, масле, tp молоке, сырах, пиве, кофе, какао, меде, специях и т. д.

Ацетоин и диацетил вносят в маргарин и другие отвержденные растительные масла для придания им запаха сливочного масла. 1,:

Ацетоин также используется в пищевой и витаминной промышленности в качестве антиоксиданта — вещества, предохраняющего масла, жиры и растворимые витаминные препараты от окисления. 20

Ацетоин образуется в культуральной жидкости некоторых микроорганизмов (1), (2). Однако в культуральной жидкости ацетоин обнаруживали аналитически и из среды не выделяли. 25

Получают ацетоин обычно путем химического синтеза.

Известен способ выделения ацетоина из раствора, предусматривающий экстракцию органическим растворителем с последую- 30 щпм упарпванпем (3). При этом ацетоин выделяют из химической реакционной смеси. Все операции проводят в токе азота, что усложняет аппаратурное оформление процесса и увеличивает потери ацетоина, обладающего высокой летучестью, за счет уноса газом. Полученный продукт представляет собой ацетоин, который быстро окисляется воздухом и не подлежит длительному хранению.

Целью изобретения является увеличение срока хранения конечного продукта и упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что в качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмов — продуцентов, при этом перед экстракцией культуральпую жидкость обрабатывают серной кислотой для удаления примесей, а после упаривания продукт кристаллизуют в присутствии гранулированного цинка. В качестве продуцентов ацетоина используют бактерии Aегоbacter (Entегоbacter) cloacae

ИНМИ-ЗО, или Erwinia corotovora ВКМ

В-567, или Aегоbacter (Entегоbacter) aегоgenes ВКМ B-887, выращенные на углеводных средах.

Способ осуществляют следующим образом.

Бактерии указанных видов культивируют на минеральной питательной среде с глюкозой или мелассой в качестве источники углерода. При этом в культуральной жидкости накапливается 17 — 19 г/л внеклеточного ацетоина. Культуральную жидкость, освобожденную от клеток, обрабатывают концентрированной серной кислотой. При этом осаждаются побочные продукты, препятствующие выделению ацетоина.

Необходимо использовать именно серную кислоту, так как только ею переводятся в осадок основные мешающие примеси, другими кислотами примеси не есаждаются.

Осадок отделяют и ацетоин экстрагируют эфиром.

Кислый экстракт сушат прокаленным поташом, Поташ, имея щелочную реакцию, одновременно осушает и подщелачивает экстракт. Подщелачивание экстракта необходимо, потому что щелочная среда предотвращает окисление ацетоина в диацетил при дальнейшем нагревании.

Упаривание эфира проводят при атмосферном давлении и температуре бани не выше 45 — 50 С, Эфир удаляют полностью.

Остаток после упаривания экстракта еще содержит примеси, избавиться от которых с помощью разгонки невозможно из-за летучести ацетоина. С целью выделения ацетоина из остатка используют его свойство образовывать кристаллический димер, который получают в присутствии гранулированного цинка.

Идентификацию полученного ацетоина проводят методами газожидкостной хроматографии, ИК-, ЯМР-спектроскопии, определением точки плавления и элементного состава.

Пример 1. Штамм Aегоbacter (Entегоbacter) cloacae ИНМИ-30 выращивают в пробирках на мясо-пептонном агаре (МПА) при 26 С. Через 48 ч роста культуру с

МПА пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды. Пересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с МПА стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на 16 колб, содержащих по

50 мл среды.

Состав жидкой питательной среды, вес. %:

Глюкоза 10,0

NH4С1 0,6

КН2Р04 0,1

Мазо, 0,03

СаСОЗ 3,4

Дистиллированная вода Остальное рН среды до и после стерилизации 6,9.

Стерилизацию солевой среды без глюкозы и СаСО> проводят в автоклаве при 116 С (3/4 атм). Глюкозу в виде 50%-ного раствора в дистиллированной воде стерилизуют в автоклаве при 110 С (1/2 атм), СаСО> расфасованный по 1,7 г в сухих пробирках, стерилизуют сухим жаром при 170 С. Раствор мелассы и СаСО> вносят в колбы с ос5

G0

65 новной солевой средой перед засевом ее бактериями.

Ферментацию проводят при непрерывном перемешивании на качалке, 220 об/мин, 26 С в течение 5 суток, после чего центрифугированием биомассу отделяют от жидкой среды.

200 мл культуральной жидкости с содержанием ацетоина 17 г/л обрабатывают 5 мл концентрированной серной кислоты и помещают в холодильник для формирования осадка. Образовавшийся аморфный осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре № 4 и промывают эфиром. Фильтрат вместе с промывным эфиром переносят в делительную воронку и энергично встряхивают в течение 5 мин.

Экстракцию производят многократно диэтиловым эфиром. Образующуюся эмульсию разрушают фильтрованием через стеклянный фильтр № 4. Объединенный. эфирный экстракт нейтрализуют и сушат прокаленным поташом. Поташ отфильтровывают и промывают на фильтре абсолютным эфиром. Фильтрат и промывной эфир объединяют, упаривают при 50 С до прекращения выделения паров эфира. В остаток вносят

3 гранулы цинка. Смесь помещают в морозильную камеру холодильника на сутки.

Образовавшиеся бесцветные кристаллы димера ацетоина отжимают на фильтре, перекристаллизовывают из ацетона и сушат в вакуумном эксикаторе над P.Os и парафином. Выход ацетоина 1,88 г (55,3%).

Пример 2. Штамм Ermini corotovora

ВКМ В-567 выращивают в пробирках на картофельном агаре при 26 С. Через 48 ч роста культуру с картофельного агара пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды с мелассой в качестве источника углерода.

Состав жидкой питательной среды вес. %:

Меласса 20,0

NH4C1 0,5

КН Р04 0,1

Мдзо, 0,03

СаСОЗ 3,4

Дистиллированная вода Остальное

Пересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с картофельного агара, стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на

10 колб, содержащих 50 мл среды, Далее аналогично описанному в примере 1 получают культуральную жидкость с содержанием ацетоина 13 г/л 200 мл. Культуральную жидкость обрабатывают аналогично описанному в примере 1. Выход ацетоина

1,38 г (53 1% ) .

Пример 3. Ферментацию штамма

Aегоbacter (Entегоb aeter) aегоgenes

ВКМ-В-887 проводят аналогично описанному в примере 1, а экстракцию культуральной жидкости с содержанием ацетоина

18,5 г/л проводят непрерывно. Остаток пос777059

Составитель Т. Мелентьева

Корректор В. Борисова

Редактор П. Горькова

Техред И. Пеичко

Заказ 2543/10 Изд. Мв 598 Тираж 522 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4)5

Типография, пр, Сапунова, 2 ле упаривания с внесенным fi него цинком перемешивают магнитной мешалкой при охлаждении (баня с ацетоном и сухим льдом) в течение 2 ч. Затем смесь помещают в холодильник, Выход ацетоина 1,68 г (45,3%).

Описанный способ позволяет осуществить выделение ацетоина из культуральной жидкости, полученной ферментацией микроорганизмов — продуцентов ацетоина. Препарат, полученный микробиологическим синтезом, выделяют химически чистым, в виде кристаллического димера. Он более устойчив к хранению, чем жидкая форма ацетоина и может быть использован в пищевой и витаминной промышленности. Возможность проведения всех операций выделения без тока азота упрощает и удешевляет процесс, одновременно исключая потери ацетоина за счет уноса.

Формула изобретения

1. Способ выделения ацетоина из раствора, предусматривающий экстракцию его органическим растворителем с последующим упариванием, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью увеличения срока хранения конечного продукта и упрощения процесса, в качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмовпродуцентов, при этом перед экстракцией культуральную жидкость обрабатывают серной кислотой для удаления примесей, а после упаривания продукт кристаллизуют в

5 присутствии гранулированного цинка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерии.

Aегоbacter (Entегоbacter) c1oacae

1Р ИНМИ-ЗО.

3, Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерии Erwinia corotovora ВКМ В-567.

4. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и с я

15 тем, что в качестве продуцента используют бактерии Aегоbacter (Entегоbacter) aегоgenes ВКМ В-887.

5. Способ по пп. 1, 2, 3, 4, отл и ч а юшийся тем, что микроорганизмы — проду2р центы выращивают на углеводных средах, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.. Патент Японии Мв 48-14952, кл.

36/2/D 23, опублик. 1973.

2. Авторское свидетельство СССР

Кэ 200414, кл. А 23С 15/02, 1967.

3. Меррей А., Уильямс Д. Л. Синтезы органических соединений с изотопами углерода, ч. 2, М., ИЛ., 1962, с. 47.