Способ получения антибиотического комплекса
Союз Советских
Социалистических
Республик .
1111786914
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15.04.77(21) 2469957/28-13 (23) Приоритет — (32) 15. 04. 76 (5()/4 (л 3
С 12 D 9/00
Государствеииый комитет
СССР ио делам изобретений и открытий (31) 677480
Опубликовано 071280Бюллетень ¹ 45
Дата опубликования описания 09.12,80 (5З) УДК 615. 779. . 9 (088. 8) Иностранцы
Дональд Е.Неттлтон (младший), Джеймс и Ричард Х.Шрайбер (72) Авторы изобретения (СШР.) 1
1 з. °
1,;"
1 (" ба ов,, !
Иностранная фирма
"Бристоль-Мейерд Компани" (71) Заявитель (СШР.) 1 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И1ТИБИОТИЧБСКОГО
КОМПЛБКСЛ гце R — водород (антибиотик мусетамицин) с и
«/ (антибиотик марцелОи OH или ломицин)
10 Эта цель достигается тем, что штамм Actinosporangium sp. АТСС 31127 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода с последующим выделением из культуральной жидкости комплекса и раз,елением его на мусетамицин и марцелломицин.
Кроме того, целевой продукт выделяют экстракцией органическим растворителем, несмешивающимся с водой.
А антибиотический комплекс разделяют с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
Мусетамицин и марцелломицин допол25 нител. но очищают с помощью жидкостной хроматографии под высоким давлением.
Штамм Actinosporangiun sp.ATCC
31127 получен из образца тточвы, взятого в Онтарио (Канада) и депониро001Н О OEJ сн,сн, OH 0 OH
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства антибиотиков.
Предложенные антибиотики новые и способ их получения в патентной и научно- ехнической литературе не описан.
Целью изобретения является получение антибиотического комплекса общей формулы:
A. Баш, ильям T.Бфздттер.-I
786914 ван в Американской коллекции типов культур, БамингToH Д.С.
Штамм образует спорангизподобное тело (ложный спорангий) на конце спорофоры, представляющее собой агломерацию плотно извитой цепи спор.
Споры .переплетаются с воздушными гифами. Спорангиеподобное тело и воздушный мицелий образуются на глю-! козо-аспарагиновом агаре, тирозиновом агаре, агаре с дрожжевым и солодовым экстрактом и агаре с овсяной мукой. Споры в телах спорангиевого типа гладкие на поверхности, эллипсоидальные по форме и неподвижные.
Первичный мицелий разветвленный, не разделенный перегородками и не об- 15 разующий фрагменты.
Штамм хорошо растет на большинстве агаровых сред.
Культуральные свойства.
Сахарозо-нитратный агар. Рост 2О умеренный, субстратный мицелий желтова-.о-красный, воздушный мицелий скудныи, беловатый, пигмент отсутствуетГлюкозо-аспарагиновый агар. Рост хороший, субстратный мицелий от красновато-оранжевого,до красного, воздушный мицелий обильный, с сероватой листвой, пигмент — отсутствует или красновато-оранжевый.
Глицерино-аспарагиновый агар. Рост хороший, субстратный мицелий розовый, воздушный мицелий умеренный светлосерый до бледно-розового, пигмент отсутствует или красновато-розовый.
Крахмальный агар с неорганическими солями. Рост умеренный, субстратный мицелий красновато-оранжевый до ярко-красного, воздушный мицелий плохой, зеленоватая листва, пигмент светло-оранжевый, частично светло-желтый. 40
Тирозиновый агар. Рост хороший, субстратный мицелий бурый до красновато-бурого, субстратный мицелий зеленоватая.листва, пигмент темнобурый.
Агар с солодовьм и дрожжевым экст- „ рактом. Рост хороший, субстратный мицелий ярко-красный, воздушный мицелий умеренный, цвета Сероватой листвы, частично зеленовато-розовой, пигмент светлобурый.
Агар с овсяной мукой. Рост умеренный, субстратный мицелий яркий красновато-оранжевый, воздушный мицелий цвета сероватой листвы, пигмент ярко-оранжевый.
Физиологические свойства. 55
Оптимальный рост при 28 С. Умеренный рост при 20-37оC. Медленный рост при 15оС, не растет при 10о и 43оС
Нитраты восстанавливает, на агаре со снятым молоком образует мицелиаль- 60 ный пигмент от ярко-желтовато-красного до пурпурного цвета.
103-ный раствор снятого молока не пептонизирует и не коагулирует, окрашивает в красновато-оранжевый цвет. 65
Желатин разжижает, меланин образует.
Усваивает арабинозу, D-ксилозу, рибозу, L-рамнозу, 0-глюкозу, D-галактозу, фруктозу, маннозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, мелабиозу, раффинозу, растворимый крахмал, глицерин, инозит, маннит.
Не усваивает U-арабинозу, малезитозу, целлюлозу, сорбит, фульцит.
Антибиотический комплекс получают культивированием штамма Асtimosporànglum sp, ATCC 31127 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей усваив,.емые источники углерода, например сахароэу, лактозу, мальтозу, маннозу, фруктозу, глюкозу, глицерин и растворимый крахмал. В качестве усваиваемого источника азота используют, например, рыбную муку, пептон, соевую муку, арахисовый порошок, порошок семян хлопчатника или кукурузный экстракт. В среду также вводят неорганические соли, такие как соли натрия, калия, аммония, кальция, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, нитрата, карбоната.
Выращивание осуществляют при тем ературе 20-37ОС, предпочтительно при температуре 27ОС.
Среда должна быть слабощелочная.
Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера или ферментерах разной емкости.
Для ферментации в резервуарах получают затравочный материал в питательном бульоне путем инокуляции небольшого объема культуральной среды. Затравку переносят в асептических условиях в резервуар с ферментативной средой.
В культуральную среду вдувают стерильный воздух.
Получение антибиотического комплекса достигают после инкубации в течение 190-210 ч во взбалтываемых ферментерах. За ходом ферментации следят путем анализа ферментативной среды на воздействие организма, чувствительного к комплексу, например D.pneum
oniac, St.pyogenes или S.aureus.
Антибиотический комплекс извлекают иэ ферментативной среды экстрагированием не смешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, метилизобутилкетон или н-бутанол при рН 7,5-8,5. Органическую фазу затем фильтруют и высушивают с получением твердого комплекса.
Антибиотики мусеттамицин и марцелломицин разделяют друг от друга и других компонентов комплекса хроматографией на колонке, заполненного сефадексом ЬН вЂ” 20.
Компоненты комплекса затем элюируют из адсорбеита подходящим органическим растворителем, таким как хлороформ. Многочи;.-н нные фракции со- " бирают и при поп>.едящем разведении, 786914 определяют их адсорбирующую способность при 490 нм.
Полученные величины нанося на график в зависимости от номеров фракций для определения пиков для компонентов элюированных из колонки. Подходящие фракции соединяют и упаривают с получением отдельных твердых антибиотиков.
l Таблица 1
Йсследуем
Бактерии
Streptococcus pnemoniae A-9585 0,3 -0,06
A-9604 0,003-0,06
А-9597 1 -0,5
A-9537 1 -1
А-15119
A-21780
A-9977
125)125
32 - 32
125)125
А 9900 )125)125
Грибки
Candida albicaus
Candida tropicalis
Candida krusei
А-9540
A-15051
A-15052
A-1503
A-9870
125-125
125-63
125-125
125-63
125-125
Сrytococens neoformans
Trichophytion ента превышала минимальную ингибиторную концентрацию. Дозировка для применения в качестве противоопухолевого средства для млекопитающего п составляет 2,5-10 мг/м при однократной инъекции для марцелломицина и 10-40 мг/м при однократной инъекции для мусетамицина.
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Штамм микроорганизма Actinosporangium sp. (АТСС.
31127) выращивают на среде косого агара, содержащей 2 г 3 -глюкозы, 20 г овсяной муки, 2 г соевого пептона и 2 r агара в одном литре дистиллированной воды. После выращивания в течение не менее б дней при
40 27оС споры переносят в колбу Эрленмейера емкостью в 500 мл, содержащую
100 мл стерильной среды, содержащей
30 г 2 -глюкозы, 10 r соевой муки, 10 г "Фармамедиа" и 3 г СаСО на один литр дистиллированной воды. ПолученStreptococcus pyogenus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Escherichia coli
R1ebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
LDSo, дающая острое отравление при внутрибрюшинном введении мышам, составляет 9,8-21,12 мк/кг мусетамицина и 6,35-10,56 мг/кг для марцелломицина
Обработка животных ферментативным бульоном, содержащим антибиотический комплекс, вызывает 73Ъ ингибирования роста опухолей по сравнению с необработанными контрольными опухолями.
Антибиотический комплекс и его компоненты мусетамицин и марцелло мицин, их соли и смеси оказывают как противомикробное, так и противоопухолевое действие.
Препараты могут быть в любой лекарственной форме — таблетках, капсулах, пилюлях, порошках и гранулах, а также жидкие препараты для перорального введения, такие как растворы, суспензии, сиропы и элексиры.
Для применения в качестве антибактериального средства препараты вводят в организм таким образом, чтобы концентрация активного ингредиКомпоненты мусетамицин и марцелломицин подвергают дальнейшей очистке с применением жидкостной хроматогра" фии под высоким давлением.
В табл. 1 представлен противомикробный спектр мусетамицина и марцеломицина.
786914. у",. культуру»ыдерх<ива>оI >3 термостате прк 27 С во нзбалтывагощем много><русном смесителе, делгпощем 210 об/
/мкн. !ерез 48 ч 4 мл культуры переносят н колбу Эрленмейера емкостью
500 мл, содержащую 100 мл стерильной процуцкрующей среды, содержащей 50 г глицерина, 20 г соевой мукк, 10 г арахисоного порошка и 10 г СаСС> на один литр дистиллйронанной воды.
Культуру выдерживают в термостате при 37ОС в. течение 144 часов, помещенном в устройстве для взбалтынанкя,производящего 230 об/мин. В этот момент определяют антибиотическую активность культурального и фильтрата, проявляющуюся за счет антибиотического комплекса кислоты.
Пример 2. Антибкотический комплекс получают в ферментерах со нзбалтынанием с применением 48-часовой культуры, описанной в приме- gg ре 1. 400 мл культуры переносят в
10 л стерильной продуцирующей среды, описанной н примере 1, содержащей
0,016 силиконового антипенного средства "Кодак > 1", содержащейся во взбалтывателе емкость>о 14 л. Взбалтыватель устанавливают н систему
<1>ерментеров. Поддерживают температуру 270С, скорость потока воздуха л/мин, скорость перемешивания
300 об/мкн. Лнтипенное средство "Хо- 30 даг > 1" пода>от автоматически по мере необходимости для контроля пенообразования. Примерно через 210 ч инкубацкю заканчивают, и .н культуральной среде и мицеллии находят антибиоти- 35 ческий комплекс.
Пример 3. 4>ерментер-резервуар с 37,8 л стерильной продуцкрующей среды (как н примере 1) ийокулируют
1,89 л вегетативной культуры (полу- >1П ченной по методике примера 1), к смесь перемешинают с помощью пропел" лерной мешалки, делающей 300 оборотов н минуту,.осущестнляют аэрацию со скоростью 85 л/мин, к смесь выдерживают I> термостате прк 27 С в течение а
190 ч. В культуральном фильтрате.и мицелии находят анткбиотический комплекс.
Пример 4. Резервуар-ферментер с 3028 л продуцирующей среды (см. пример 1) инокулируют 152 л вегета тинной культуры (получение см. в примере 1), перемешинаемой пропеллерной мешалкой, делающей 155 об/мкн, аэрируют при скорости подачи воздуха 55
141,6 л/мин и выдерживают при 27 С
О в течение 190 ч. В этот момент в культуральном фильтрате и мицелии обнаруживают присутствие комплекса.
Пример 5. Весь.ферментатив- 60 ный бульон (7 л) со значением рН 8,1 перемешивают с равным объемом метилизобутилкетона в течение 20-30 мин.
Затем,цобавлягот большое количество диатомоной земли в качестве фильтрую- 65 щего средства к после тщательного перемешинапия смеси ее фильтруют через фильтровальное средство при ва- куумиронанки. <1>кльт13ат разделяют на две фазы, из которых нижнюю (водную) отбрасывают. Органическую фазу упаривают под вакуумом до небольшого объема 150-100 мл),разбанляют Скеллисольном B и осаждают твердое вещество ярко-красного цвета, которое высушивают под вакуумом с получением
1,9 г комплекса.
Пример 6. Весь ферментативный бульон 18000 л) прк рН 8,0-8,5 охлаждают до 25 С и интенсивно перемешивают с 3000 л метилизобутилкетона в течение 30 мин при 20-ЗООС. К эмульсии добавляют 360 кг фильтровального средства и смесь интенсивно перемешива>от и течение еще одного часа. Затем смесь отстаивают в течение примерно 30 мин, после чего 23002500 л органической фазы декантируют к охлаждают до 0-10ОC. Добавляют еще
800 л метилкзобутилкетона при перемешивании смеси в течение 20 мин, декантируют после отстаивания в течение 30 мин и смесь соединяют с охлажценной первой фракцией с получением общего объема экстракта 33003400 л. Смесь фильтруют с получением
1н конечном снеre 3100-3200 л метилкзобутилкетононого экстракта, не содержащего твердых частиц и нерастворимой водной фазы. Органический экстракт концентрируют .под вакуумом при 0-10 С до окончательного объема
6 л. Полученный концентрат добавля>от к 60 л Скеллксольна В с перемешиванием при 20-25ОС. Выпанший осадок собирают на нутч-фильтре, промывают
10 л Скеллксольва В к отсасывают с полученкем 900-1000 г несколь><о маслянистого и темно-красного аморфного продукта, Полученный продукт перемешивают с избытком эфира, фильтруют через воронку Б>охнера, промывают дополнительным количеством эфира, отсасывают н сухом состоянии и высушива>от под вакy óìoì с получением 351 г аморфного анткбкотического комплекса красного цвета.
П р к м е р 7. Сефадекс 1 Н-20, пропитанный н течение 68 ч хлороформом, помеща>от н колонку, заполненную продуктом "фармасиа $1< . 25/100" (внутренник диаметр — 25 мм, высота — 100 мм), снабженную с каждого конца регулируемыми насадками из тефлона. Колонку наполняют таким образом, чтобы она была полностью наполнена от одного конца до другого с образованием эффективного слоя высотой 90-95 <.-;i. Комплекс богеминовой кислоты (500 мг) растворяют в
10 мл хлорофо1.м» и вводят в колонку, которую затем::.;..оявяяют хлороформом, пропускаемым с:.:ерху вниз со скорос- тью 1 мл/M)IH. . х<гкрованну>о жидкость
786914
Первая полоса
18 глг
48 мг фракция
Описание
Х
1-й компонент, смесь, неактивный
ХХ
2-й компонент, смесь, неактивный впадина — отбрасывают
1-20
21-44
6,74
4,18
45-53
0,385
3-й компонент, одно соединение мусетамицин, активный
54-70
1,45
0,198
71-75
76 — 110
4-й компонент, смесь, содержащая преимущественно марцелломицин, активный
4,03
1, 72
„,<показано тонкослойной хроматографией х преимущественно -пирримицинон. собирают в виде фракций по 6 мл в сборнике фракций. Образцы, помещенные в пронумерованные пробирки, разбавляют 80-ти кратным количеством хлороформа и помещают в калориметр Воша при 490 мр. Отмечают четыре следующие полосы антрациклиновых пигмента:
Р пробирки Вес после упаривания
1-4
5-11 66 мг О
12-14
15-21 Вторая полоса 36 мг
22-35
36-44 Третья полоса
46-57 Четвертая полоса
58
Полученные твердые вещества хроматографируют на силикагеле Бринкма11-. на 607254, помещенном на пластины 2О для тонкослойной хроматографии, с применением системы растворителей, содержащей толуол и метанол (80:20) .
Первая полоса, как показывают результаты тонкослойной хроматографии, отражает комплексную неактивную смесь.
Вторая полоса дает характерную оранжево-красную зону с величиной 1 = — 0,75. Эта фракция также неактивна, и, как было найдено, она содержит преимущественно пирромицинон. Третья 30 фракция элюирования образует единичную зону с величиной Р, равной примерно 0,3. Эта фракция, как было установлено, соответствует мусетамицину, обладающему высокой активностью при 35 испытании на системах лейкемий 1.-1210 и P-388 у мышей. Последняя полоса дает зону со значением 1< примерно
0,3 и содержит преимущественно марцелломицин. Этот компонент также обладает высокой активностью при испытании на два типа лейкемий у мышей, Хотя как мусетамицин, так и марцелвпадина — отбрасывают
111-200 послед„ющие фракции ломицин при тонкослойной хроматографии дают величину К<,, составляющую примерно 0,3, мусетамицин движется г немного быстрее. При pàçäåëåíèii смеси мусеттамицина и гларцеллом111ти11а Об разуются две зоны, Весьма близкие по цвету.
Пример 8. Стеклянную колонку диаметром 15,2 см и высотой 184 см снабжают у ее основания незабивающимся фильтром, 11а вершину которого помещают слой стекловолокна, а еще Выше круглую пластинку из полиэтилена.
Последнюю отрезают до диаметра
14, 9 см с целью набу .àIIIIÿ в хлороформе. Сефадекс Н-20 8,73 кг перемешивают в течение 3 ч в хлороформе, фильтру1от и твердый матер;-,"ал повторно наслаивают хлороформом, после чего отстаивают В те is! II:е 16 ч. Смесь затем перемешиваот в те-:. 11:e 15:<и1 . и загружают н колонку. 30 г Образца кОмплекса (ПОлучег!ие Описа1<о В пр!1 мере 6) нагреваю - с 1 „».," х-1ороформа в течение 15 мин, а з<1те.1 пере :=-шивают в течение 16 ч. Посла фильтроВания отделя1от 7, 5 г 11ерастворе:-1но1. о материала, cQ Fp<<=..нце1 О нгзко. Орое i<0 личество активного гещ=.ñòва. фнльтpclт ВВОдят В 1<ОлОн c B 8 p x y B H I i 3 . D т е -" е и и е в < . е i 1 О и е р а ц 1.1 и поддерживают скорость по;о1<а хлороформа 16 мл/мин. Перед те:.1, как цве— тообразование дости."нет дна слоя геля, начальный Объем злюента составляет 1445 мл. В этот глок1ент начи11а1<1т собирать фракi,ии па 100 мл; и зту операцию продол:кают до получения совершенно светлой жидкости (Всего 906 фракций) . Равные ) Т а б .1! и U a ! Вес пос "",å уп ар11ь а —: II.I, т 786914 Пример 9. Твердо< вещество 421,4 мг, полученное из третьего компонента примера 8, растворяют в и з бbITI Пример 10. Мусетамицин, :промытый этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТК), пропускают через четыре системы колонок <Ц-СТИРАГЕЛЬ с использованием хлороформа в качестве подвижной фа"û со скоростью потока 0,7 мл/мин в начале процесса. Производят девять опытов с использованием по 100 r. Элюирование записывают с помощью детектора показателя преломления и собирают фракции, дающие основной пик (37,5-45 мин). Осйовную фракцию, взятую из девяти опытов, соединяют и упаривают досуха под вакуумом. Аморфное твердое вещество темно-красного цвета 660 мг растворяют в 22 мл смеси растворителей (45:55) из ацетонитрила и 0,01 Yi ацетата натрия, РН 4,0. Смесь центрифугируют для удаления небольшого количества суспендированного материала, и прозрачный верхний слой переносят в закрытую пенициллиновую склянку. Часть (1,25 мл, примерно 37 мг) раствора темно-красного цвета загружают.в инъектор, а затем образец загру>кают в колонку. Образец хроматографируют в колонке из нер>кавеющей стали длиной 1 м и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной "Фенил/ПОРАСИЛОМ В" (размеры частиц 3775 мкм). Подвижная фаза содержит смесь ацетонитрила и 0,01 М ацетата натрия (35:65) с РН 4,0 (скорость потока — 1,9-2,0 мл/мин). Элюирование записывают с помощью регистратора показателя преломления. Фракции собирают с интервалами в 75 c c помощью автоматического сборщика фракций. Собирают фракции в 120 пробирок и колонку промывают со скоростью 3,0 мл/мин метанолом в течение 15 мин, водой в течение 15 мин, смесью ацетонитрила и 0,01 M ацетата натрия (35:65) при РН 4 в течение 15 мин, Скорость потока снижают до 2,0 мл/мин и систему нейтрализуют за 5 мин перед инъецированием. По 25 мкм элюента каждой пятой пробирки хроматографируют на аналитической системе для определения состава перед комбинированием пробирок. Аналитическая система содержит колонку из нержавеющей стали длиной 61 см и внутренним диаметром .2,1 мм, заполненную "Фенил/КОРАСИЛОМ", (состо IT из твердых стеклянных шари-< ков, покрытых одним слоем кремнезема, к которому присоединен дифенилдихлорсилан, размер частиц 37-50 мкм). Подвижная фаза представляет собой смесь (45:55) ацетонитрила с 0,01 M 10 ацетатом натрия с РН 4,0, при скорости потока 0,7 мл/мин. Элюент записывают с помощью УФ-детектора при 254 нм. Комбина™ию пробирок выполняют на основании анализа хроматограмм. Пробирки 21-120 содержат целевой му" сеттамицин. Содержимое этих пробирок соединяют и упариваI<>T под вакуумом (45 С). Остатки темно-красного цвета 0 промывают несколько раз метанолом и дважды по 100 мл дихлорметаном. Остаток затем растирают со 100 мл хлороформа и фильтруют для удаления неорганических солей. Твердый осадок затем упаривают досуха с помощью сухого азота и высушивают под вакуумом с помощью фосфорного ангидрида, Мусеттамицин, очищенный по методике, приведенной выше, характеризуется следующими данными: Кристаллический порошок темно30 красного цвета. Молекулярная формула: СЗ„Н 50ММ, Молекулярный вес: 715,76. Элементарный анализ: Теоретически: С 60,41, Н 6,34; 35 N 1,95. Найдено; С 60,27; Н 6,59, < 1,99. Учитывая поправки на присутствие 0,83 воды и 0,83 остатка: С 60,27, Н 6,50, 14 1,99. 4О ИК-спектр: Спектр поглощения инфракрасных лучей для мусеттамицина (гранулы KBI)показывает большие полосы при следующих длинах волн: 3480, 2970, 2930, 2820, 2770, 1735, 1600, 1450, 1320, 1295, 1220, 1160, 1010 и 990 см УФ-спектр: При концентрации 0,013 г/л в метаноле;лусеттамицин показывает следующие максимумы поглощения: 233 м». 57,7, 256 мр, 33,2, 50 284 м)<, 14,5, 466 м)<, 14,3, 490 м)ц, 17,4, 510 мц, 14,6, 524 м><, 12,9 и 570 м 4, 3,3. Т. пл. 210 †21>C. Растворим в большинстве органических растворителей, нерастворим в воде, алифатических углеводородах и эфире. Пример 11. Неочищенный марцелломицин, промытый ЭДТК, подвергают начальной очистке с применением системы из четь>рех колонок -СТИРАГЕЛЯ при использовании хлороформа в качестве подвижной фазы. Скорость потока,цля такого разделения составля ет 0,6-0,7 мп/мнн, и элюирование за13 786914 писывают с помощью детектора показателя преломления. Производят 10 проходов по 100 мг, и в каждом случае собирают фракцию, элюирование которой происходит эа 26-32 мин. Основную фракцию из 10 пропусканий соединяют и упаривают досуха под вакуумом. Аморфное твердое вещество темно-красного цвета разделяют на 25 фракций по 30-35 мг. Каждую фракцию растворяют в 1,0 мл смеси (45:55) ацетонитрила и 0,01 М ацетата натрия (рН 4,0) непосредственно перед загрузкой в хроматографическую систему, представляющую собой колонку из нержавеющей стали размером 1 м х4,6 мм,заполненную: "Фенил/IIOPACHJIOM B" (содержит совер- 15 шенно пористый кремнезем с жидкой фазой иэ дифенилдихлорсилана, химически связанного с кремнеземом (размеры частиц — 37-75 мкм). Подвижной фазой является смесь (45:55) ацетонитрила 2О и 0,01 М ацетата натрия, рН составляет 4,0, скорость потока 3,0 мл/мин. Элюирование записывают с помощью монитора разности показателей преломления. Фракции собирают с интервалом 1,0 минуты с помощью сборщика фракции М 1. Содержимое 59 пробирок собирают и колонку промывают со скоростью потока 4,0 мл/мин ацетонитрилом и в течение 15 мин подвижной фазой перед инъецированием. Элюенты, содержащиеся в каждой пятой пробирке, хроматографируют на аналитической системе, после чего содержимое пробирок соединяют. Аналитическая система представляет собой колонку из нержавею- 35 щей стали длиной 61 см и внутренним диаметром 2,1 мм, заполненной "Фенил/ /КОРАСИЛОМ" (содержит твердые стеклянные шарики, покрытые одним слоем кремнезема, к которому химически при- 40 соединен дифенилдихлорсилан) (размер частиц — 37-50 мкм). Подвижная фаза содержит смесь (45:55) ацетонитрила с 0,01 М ацетатом натрия (рН 4,0), скорость потока 0,68-7,0 мл/мин. Элюирование записывают с помощью УФ-детектора при 254 ммкм.В эту систему инъецируют 25 мл элюента. Комбинацию пробирс»к производят на основании аналитических хроматограмм. В общем, как было установлено, пробирки 18-35 содержат исключительно целевой марцелломицин. Содержимые этих пробирок соединяют и упаривают досуха под вакуумом при 45 С. Остаток быстро промывают метанолом . 55 и дважды по 100 мл дихлорметана. Остаток растирают с 75 мл дихлорметана и смесь отфильтровывают. Фильтрат упаривают под вакуумом (450С) досуха. Ярко-красный остаток затем высушивают в высоком вакууме над фосфорным ангидридом. Марцелломицин после описанной выше очистки характеризуется следующими данными: Аморфный порошок темно-красного двета. Молекулярная формула С» НЭ5NO Молекулярный вес: 845,90. Элементарный анализ: Теоретически: С 59,64; Н 6,55; N 1,65; О 32,15. Найдено: С 56,32; Н 6,64; N 1,74. Поправка на воду и.остаток: С 58,77;-Н 6,77; N 1,82. ИК-спектр: Спектр поглощения инфракрасных лучей для марцелломицина (гранулы КВ») показывает большие полосы со следующими длинами волн: 3450, 2960, 2940, 2820, 2790, 1730, 1615, 1600, 1450, 1260, 1095, 1010 и 800 см . УФ-спектр: При концентрации 0,013 г/л в метаноле марцелломицин показывает следующие максимумы и адсорбционные способности: 233 мр, 47,5; 256 иц, плато, 24,7; 284 м)», плато, 10,6; 490 м », 15,8; 410 м)», плато, 3,4; 4,65 м)», плато, 13,2, 480 м ц. плато, 14,7; 510 м », плато, 12,5; 524 м », плато,, 10,6; 580 м)», плато, 1,1. Точка плавления: размягчение при 134-135 С, постепенное загустевание без плавления при температуре до 300вС. Предлагаемый способ позволяет получить антибиотический комплекс, содержащий антибиотики марцелломицин и мусеттамицин, обладающие противоопухолевым действием, Формула изобретения 1. Способ получения антибиотического комплекса общей формулы (,ООСИ, О ОН Н0 0 OH 9 Ofl 0 к где к — водород (антибиотик мусеттамицин) сн (антибиотик марцелломицин), или 786914 Составитель С. Малютина ТехредЕ.Гаврилешко Коррект Редактор С. Титова Заказ 10668/73 Тираж 522 Псдннсное,ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д.4/: Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проект . 4 о т л и ч а 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что целевой продукт выделяют экстракцией органическим растворителем, несмешивающимся с водой. 3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что антнбиотический комплекс разделяют с помощью гельf 5 фильтрационной хроматограФии. 4. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ H и с я тем, что мусетамицин и марцелломицин дополнительно очищают с помощью жидкостной хроматографии под высоким давлением.р1<рова11ну>о фильтровальную бумагу. <Ьильтрат кипятят до получения менее 20 мл на паровой бане. Затем к теплому раствору добавляют Скеллисольв В до достйжения момента помутнения, после чего добаBJIHIOT несколько капель хлороформа. После охла>кдения до температуры окружающей среды смесь помещают на ночь в холодильник при -20ОС. Собирают кристаллические пластинки ярко-красного цвета и высушивают под вакуумом с получением 358 мг мусетамицина, т.пл. 162-163ОС
