Способ получения рибонуклеаз из
Союз Советскмк
Соцмапмстмческмк
Республмк
ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ ()787464
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву(22) Заявлено 30.11.78 (21) 2691466/28 — 13 с присоединением заявки Ио(23) Приоритет—
Опубликовано 15.1280, Бюллетень ¹ 46
Дата опубликования описания 1712ВО (51)М. Кл.з
С 12 Э 13/10
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577. 15. .07 (088.8) (72) Авторы изобретения
О. П. Белецкая, Г. С. Иванова и Л. Г. Одинокова (71) Заявитель
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР
{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗ ИЗ
ASPERGILLUS CLAVATUS
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам одновременного получения вне- и внутриклеточных ферментов миКробиологическим путем.
Известен способ получения гуанилспецифичной внеклеточной рибонуклеазы Aspergillus clavatus, предусматривающий культивирование продуцента на комплексной питательной среде, отделение мицелия фильтрованием, осаждейие рибонуклеаэ иэ фильтрата культуральной жидкости с последующей хроматографией ферментов на
ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией.
1)осле повторной хроматографии íà ДЭА315 целлюлозе проводят гельфильтрацию на сефадексе С-75. Способ предполагает получение только одного фермента из материала одной ферментации (1) .
Недостатками данного способа яв- 20 ляются невысокий -выход фермента и получение только одного фермента.
Цель изобретения — повышение выхода целевых продуктов, более полное использование сырья и воэможности 25 разделения неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз.
Указанная цель достигается тем, что мицелий продуцента лиофильно высушивают, экстрагируют из него бу- 30 фером при рН 4-9 внутриклеточные рибонуклеазы, а затем по единой схеме осуществляют очистку внутриклеточных и внеклеточных рибонуклеаэ, полученных осаждением иэ фильтрата культуральнои жидкости, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят разделение неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз íà QAE.сефадексе, после чего препараты неспецифичных рибонуклеаз подверга1рт гельфильтрации на сефадексе G-75 и хроматографии на Q AE-сефадексе, а препараты гуанилспецифичных рибонуклеаэ хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллиэуют.
Способ осуществляют по следующей схеме.
Гриб Aspergi11us c1avatus выращивают на комплексной питательной среде. Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат. Белки из лиофильно высушенного мицелия экстрагируют буферным раствором. Белки фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония и растворяют в буферном растворе. Белки и экстракта и раствора сорбируют иа ДЭАЭ-целпюлозе, элюируют. Элюаты хроматографируют на колонках с QAE-сефадексом
787464
Формула изобретения
Составитель Л, Белякова
Тех ед A. Ач Ко екто Г. Решетиик
Редактор Т. Кинь
Тираж 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035 Москва, Ж-35 Раушская наб. д. 4 5
Заказ 8278 25
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 для разделения неспецифичных и гуанилспецифичных РНКаз. Далее растворы неспецифичных рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на колонках с сефадексом G-75. Элюаты хроматографируют на колонках с GlAE-сефадексом, Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонках с
KM-целлюлозой, затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе.
Пример. Гриб Aspergillus с1а
vatus выращивают в ферментере на комплексной среде. Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат. Белки из лиофильно высушенного мицелия экстрагируют 0,05 М трио-НСР буфером, рН
7,5 (16 л/кг сухого мицелия) ° Белки фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония (660 г/л) и растворяют в 0,1 М трис-НСк буфере, рН 7,5. Белки из экстракта и раствора белков, осажденных сульфатом аммония, сорбируют в статике на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭсефадексе (5 г сухого сорбента/1 л), уравновешенных 0,1 М трис-HCl> буфером, рН 7,5. Элюцию проводят 2 л
0,5 M ацетатного буфера, рН 4,5. Элюат подвергают хроматографии на колонке с Q AE-сефадексом (5x50 см), элюцию проводят линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,05-0,5M), Далее очистку неспецифичных и гуанилспецифичных рибоиуклеаз проводят раздельно. Растворы неспецифичных рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом Я-75 (5x100 см), уравновешенной 0,05 М трис-HCK буфером, рН 7,05, содержащим 0,1 M KC8. Затем проводят хроматографию на колонке с С AE-сефадексом (5х50 см), фермент элюируют линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,05%0,5 M). Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонке с
КМ-целлюлозой (5х20 см), уравновешенной 0,05 М ацетатным буфером, рН 4,5. Фермент элюируют линейным градиентом 0-0,5 M NaCl в исходном буфере. Затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе против разбавленных буферов, рн 3,5, 5,0, 5,6.
Описанный способ позволяет получить в результате одного процесса культивирования по единой схеме очистки четыре фермента: неспецифичные и гуанилспецифичные вне- и внутриклеточные рибонуклеазы.
Способ получения рибонуклеаэ из
Aspergillus clavatus, предусматривающий культивирование продуцента на комплексной питательной среде, отделение культуральной жидкости от мицелия фильтрованием, осаждение рибонуклеаз из фильтрата культуральной жидкости с последующей хроматографи2О ей ферментов на ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, более полноFo использования сырья и возмо>кности разделения неспецифических и гуанилспецифических рибонуклеаз, мицелий продуцента лиофильно высушивают, экстрагируют из него буфером при рН 4-9 внутриклеточные рибонуклеазы, а затем по единой схеме осуществляют очистку внутриклеточных ферментов и внеклеточных рибонуклеаэ, полученных осаждением.из фильтрата культуральной жидкости, после хроматографии на
ДЭАЭ-целлюлозе проводят разделение неспецифических и- гуанилспецифических рибонуклеаз íà QAE-сефадексе, после чего препараты неспецифических рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на сефадексе G-75 и хроматогра4Q фии íà QAE-сефадексе, а препараты гуанилспецифичных рибонуклеаз хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллизуют.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Авторское свидетельство СССР
Р 596616, кл. С 12 D 13/00, 1978.
