Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социапистическик

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51)М. Нл (22) Заявлено 2704.79 (21) 1157604/28-13

2758949/28-13 (23) Приоритет 10,05,67 (32) С 12 0 9/00

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений и открытий (33) (31)—

Опубликовано 30,10,80. Бюллетень Йо 40 (53) УДК 615.779..931 (088.8) Дата опубликования описания 30,1080

Иностранцы

Роберт Куинси Томпсон, Уильям Макс Старк и Калвин Евгений Хиггенс (72) Авторы изобретения

b 7 (США) -,«) « -ц .!. Иностранная фирма

"Эли Лилли энд Компани" (71) Заявитель (СШ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА TEHESPHMHgHHA

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению антибиотиков.

Предложенный антибиотический комп- 5 лекс новый и способ его получения в патентной и научно-технической лите, ратуре не описан.

Целью изобретения является получение антибиотического комплекса тене- ð бримицина, содержащего фракции тенебримицина 3, 1 и 11.

Эта цель достигается тем, что штамм Streptomyces tenebrarius АТСС

17921 выращивают в питательной среде,1> содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре 37-43 С . в течение 4.-7 дней, выделяют антибиотический комплекс в свободном виде или в виде его солей и/или разделяют на составляющие его фракции.

Штамм Streptomyces tenebrar|us выделен из образца почвы посредством суспендироваиия отдельных порций об- 25 раэца почвы в стерильной дистиллированной воде с последующим переносом суспензий на питательную среду .

Штаьве Streptomyces tenebrarius хранится в коллекции культур амернканского типа в Вашингтоне (Федеративный округ Колумбия QIIA) под номером ATCC 17921.

Культурально-морфологические признаки . Воздушный мицелий и споры отсутствуют, фрагмент мицелия в состоянии вегетации в незначительных количествах.

Агар Чапека. Вегетативный рост удовлетворительный, цвет желтовато» белый, воздушный мицелий и растворимтй пигмент отсутствуют.

Агар, содержащий кальциевую соль яблочной кислоты. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий отсутствует, незначительное количество сероватокоричневого растворимого пигмента.

Пирозиновый агар. Вегетативтый

Рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Агар с неорганическими солями и крахмалом. Вегетативный мицелий удовлетворительный, цвет светлый, желтовато-коричневый растворимый пигмент.

Агар с глюкозой и аспарагином.

Вегетативный рост умеренный, цвет

776566 серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Томатная йаста с овсяной мукой.

Вегетативный мицелий умеренный, цвет желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Дрожжевой экстракт. Вегетативный мицелий умеренный, цвет светлый, желтовато-коричневый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Питательный агар. Вегетативный рост умеренный, цвет светло-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.!

Агар Беннета. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Физиологические. признаки. Действие на молоко: толстое окрашенное кольцо роста на поверхности, наблю- 20 дается коагуляция и пептонизация.

Нитраты восстанавливает..

Сероводород не образует.

Полностью сжижает желатин через

7 дней. 25

Растет при температуре 26, 30, 43, 49 и 55 С, оптимальная температура роста 37 С.

Хорошо усваивает фруктозу, маннозу, глюкозу, мальтозу, трегалоэу, i-инозитол .

Не усваивает серабинозу, рамнозу, рибозу, лактозу, сукрозу, раффинозу, целлюлозу, маннитол, d-сорбитол, салицин.

Штамм Streptomyces tenebrarius

ATCC 17921 культивируют в условиях погруженной аэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неоргани.ческих солей. 40

Штамм растет при температуре от

30 до 50 С, оптимальные температуры

37-43 С.

Штамм чувствителен к действию света и плохо растет при освещении, поэтому ферментацию осуществляют в отсутствии видимого света.

Через среду для выращивания культуры продувают стерильный воздух.

Объем воздуха, используемый в процес 0 се ферментации в крупных резервуарах, составляет свыше 0,1 объема воздуха в минуту на один объем среды.

Концентрация, характеризующая активность антибиотика в ферментационной среде, может быть прослежена посредством отбора и испытачия проб среды для выращивания на их активность в отношении ингибирования роста организмов, которые должны тормозиться в своем развитии в присут- 60 ствии тенебримицина. Для этой цели применяют организмы Klebslella pneumoniac u Micobacterium butyricum.

Мицелий и нерастворившиеся остатки удаляю= из ферментационного бульо- 65 на фильтрацией или центрифугированием. Антибиотик содержится в профильтрованном бульоне и может быть извлечен из него путем адсорбции. К числу адсорбентов, которые могут быть использованы, относятся катионообменные смолы, например, !RC-50 °

Тенебрийицин из ферментационного бульона извлекают следующим образом.

Бульон отфильтровывают с применением средств, способствующих фильтрованию, после того, как показатель рН снижен до 2 добавлением кислоты, например, .серной, фосфорной, хлористоводородной и других подобных им. После этого рН фильтрата доводят до 5 добавлением концентрированной щелочи, и смесь снова фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой !RC-50 в аммонийном цикле.

Затем колонку промывают дистиллированной водой, и антибиотик извлекают с адсорбента вымыванием разбавленной кислотой. Фракции, содержащие активное действующее начало, объединяют и концентрируют приблизительно до, 1/20 от первоначального объема. рН концентрата повышают примерно до 11 добавлением концентрированной щелочи ( после чего щелочной концентрат выливают в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выделяющийся осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношенйи, устраняют фильтрованием, рН фильтрата понижают до 3,5 добавлением 20%-ной серной кислоты при тщательном перемешивании. Тенебримицин в виде комплекса осаждается в форме сернокислой соли. Сернокислую соль тенебримицина растворяют в минимальном количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с Доуэксом.

Водный раствор сульфата тенебримицина доводят в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость, вытекающую из колонки, собирают в виде отдельных фракций. Активные фракции объединяют и концентрируют до консистенции густого сиропа, затем высушивают с целью получения тенебримицина в виде свободного основания, Основной фактор, образующий комплекс тенебримицина можно получить, если это желательно, в виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционирования на колонках, заполненных ионообменной смолой тенебримицина, полученного как описано выше. Для проведения фракционирования тенебримицин применяют в виде соли, являющейся продуктом присоединения кислоты. Пригодной солью является в данном случае сульфат.

Раствор сульфата тенебримицина удобно получать посредством приготовления

20%-ного водного раствора тенебримицина с последующей установкой показа776566

1,000

0,100

0,300

0,050

0,500

0,025

1i00 геля рН раствора приблизительно 4,5 путем добавления серной кислоты. Окрашенные примеси можно удалить с помощью перемешивания приготовленного как указано раствора примерно с 5% (весое количество по отношению к объемному) актнвированного угля, такого, например,как "Дарко G-60".Эффективное обесцвечивание достигают в результате перемешивания смеси, содержащей активированный уголь, в течение одного часа. После этого смесь фильтруют, и фильтрат, который содержит сульфат тенебримицина, помещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки IRC-50 s аммонийном цикле. Колонку промывают водой, после чего индивидуальные антибиотики, образующие комплекс тенебримицина, фракционированно отмывают в адсорбенте с помощью 0,1 н.раствора гидрата окиси аммония. Процесс элюирования идет медленно, и для получения эффекта фракционирования комплекса обычно бывает необходимо очень большое число фракций. Так, например, полное и законченное фракционированне примерно .250 r тенебримицина требует получения около 700 фракций, каждая из которых содержится примерно в 900 мл жидкости, отмываемой с адсорбента.

Первая полученная активная фракция содержит тенебримицин.

Пример 1. Ферментация S. tenebrar i us штамма ATCC 19721, Спорулированную культуру 5.tenebrarius ATCC 17921 получают посредством вырашивания организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего следующий состав, r:

Декстрнн 10,00

Дрожжевой экстракт ("Дифко")

Гидролизованный казеин (продукт под наименованием "NZамин A") 2,00

Экстракт из мяса крупного рогатого скота 1,00

CaClg 6Н О 0,01 — Промытый агар 20,00

Деионизированная вода До 1000 мл

Значение показателя концентрации водородных ионов рН доводят до 7 до автоклавирования.

Скошенную среду засевают спорами

S. tenebrar l us ATCC 17921 и культивируют в отсутствии видимого света в течение пяти дней при температуре 37 С. Культуру, выращенную на скошенной среде, покрывают водой, и наклонную поверхность осторожно соскабливают, удаляя споры с целью получения водной суспензии, содержащей споры.

Полученную укаэанным образом сус- пензию спор применяют для инокулиро-: вания среды, имеющей состав, вес.Ъ:

Декстроза 0 050

Питательная соевая мука, содержащая

35-45% диспергирующегося протеина 1,500

Декстрин с низким содержанием хлоридов

Хлористы калий

NZ-амин А

КН Р04

HgS0л 7НтО

СаС i ° 2Н О

Деионизированная вода Остальное.

Инокулированную вегетативную среду инкубируют при температуре около

37 С в течение 16 ч на аппарате для перемешивания путем встряхивания при .

2Q одновременном вращении со скоростью

250 об/мин °

Для инокулирования резервуара для посева емкостью 44 л берут водную среду следующего состава, вес.Ъ:

Декстроэа 1,000

Соевая крупа 1,500

КН1 04 0,050

И9504 0,500

Хлористый калий 0,100

Са С > ° 2Н <О О, О 25

З" Средство против вспенивания 0,025

Применяют порцию вегетативной куль- туры объемом 50 мл.

Среду, находящуюся в резервуаре для посева, стерилизуют при 120 С в течение 30 мин. Инокулированную среду в резервуаре для посева инкубируют при 379С в течение 12 ч. Перемешивание со скоростью 370 об/мин

40 начинают немедленно после инокулирования. В продолжение всего периода инкубирования осуществляют аэрацию при скорости подачи воздуха 0,22 м /мин.

К концу периода инкубации содер4 жимое резервуара для посева используют для инокулирования ферментатора емкостью 1,14 м или 0 95 мь, содержащего среду следующего соста- . ва, вес. Ъ:

Декстроз а 4,0

Соевое масло рафинированное 3,0

Соевая мука 3,0

Хлористый аммоний 0,5

Хлористый кальций 0,3

Сернокислый аммоний 0,2

Азотнокислый агоний 0,1

NZ-амин-A 0 5.

Средство против образования пены 0,2

Деиониэированная вода Остальное.

До инокУлирования ферментационную среду стерилизу10т 30 мин при

120 С, ферментацию проводят при .

37 С. Аэрацию осуществляют при ско-.

6д рости подачи воздуха 0,48 м /мин

776566

1 в течение всего периода выращивания, начиная от инокулирования ы кончая сбором выращенной культуры. Перемешивание начинают при скорости вращения мешалки 120 об/мин. Через

12 ч число оборотов мешалки увеличивают до 180. Процесс ферментации продолжают 5 дней. Полученный таким путем профильтрованный бульон после ферментации содержит комплекс, имеющий главным образом тенебримицин 11 и в меньшей пропорции — тенебримицин

1и 1

Пример 2. Изолирование комплекса тенебримицина.

Значение показателя концентрации водородных ионов у 880 л ферментационного бульона; содержащего антибиотик и полученного, как указано в примере 1, понижают приблизитИтЪно да рН-2 путем добавления 10-15 л

20%-ного водного раствора серной кислоты. К подкисленному бульону добавляют 45 кг средства, способствующего фильтрованию, тщательно перемешивают смесь и фильтруют. Отжатый осадок, оставшийся на фильтре, промывают водой и промлвные воды добавляют к фильтрату. рН Фильтрата доводят до 5,5 посредством добавления 50%-ного водного раствора гидрата окиси натрия.Добавляют примерно 4 кг средства, способствующего фильтрованию, смесь тщательно перемешивают и фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через колонку, имеющую размеры 10,2 см х х 1,8 и (4 дюйма х б футов), заполненную ионообменной смолой марки IRC-50. Колонка имеет слой смолы вйсотой 111,7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат. пропустят через колонку ; последнюю промйвают"дистйллированной водой в количестве около

200 л. Активное действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика, затем отмывают с адсорбента в течение 12-15 ч примерно 150-175 л

0,1 н.раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л каждая. Присущая антибиотику активность в составе элюата становится распознаваемой в случае снижения величины рН до 4 или несколько менее. По мере . продолжения отмывки рН элюата продолжает снижаться до тех пор, пока его значение не достигнет 1,5. Фракции содержащие активное начало антибиотика, объединяют и концентрируют при уменьшенном давлении приблизительно до 1/20 от первоначального объема. дят до 11 добавлением 50%-нОго водно"го раствора -гйдра "а окиси натрия, пос ле чего подщелоченный концентрат добавляют к б-ти объемам ацетона. Полу чейную смЕсь охлаждают и отставляют в сторону для того, чтобы дать отделиться осадку, лишенному активности, свойственной антибиотиКу. Затем смесь фильтруют и плотную массу, отжатую на фильтре, и состоящую из неактивного осадка, отбрасывают. рН устанавливают 3,5, добавляя при тщательном перемешивании 20%-ный водный раствор серной кислоты. Во время такой обработки комплекс тенебримицина осаждается в виде сульфата. Практи о чески полное осаждение достигается при рН раствора около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат содержащий церуломицин, попутно образующийся в процессе Ферментации, отбрасывают.

15 Отжатый.на фильтре осадок, являю-щийся сульфатом тенебримицина, растворяют в минимальном количестве воды и охлаждают. Все твердые вещества, растворяющиеся более или менее трудно, Щ отбрасывают, наряду со всеми твердыми веществами, выпадающими в виде осадка йли кристаллизующимися при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку

2» из ионообменной смолы марки "Дауэкс

1х1" размером 10,2 см х 2,1 м, работающую по основному циклу. Раствор антибиотика выводят иэ колонны с применением 40-50 л дистиллированной воды. Жидкость, выходящую иэ колонны, собирают отдельными фракциями,до 10л.

Активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме до консистенции густогоФ сиропа, который после высушивания на противне дает сухой тенебримицин.

Пример 3. Сульфат тенебримицина,, содержащий факторы 1, 1 и 11 получают путем добавления концентрированной серной кислоты к 20%ному водному раствору, содержащему

4р 258 r комплекса тенебримицина в виде свободного основания, с таким расчетом, чтобы рН среды стало равным

4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина перемешивают

4» примерно один час с 5% (весовое количество по отношению к объемному) активированного угля марки "Дарко 0-60,", Затем раствор фильтруют и фильтрат пропускают через колонку размером

9х105 см, заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки IRC-50 и работающую в аммонийном цикле.

После того, как Фильтрат, содержащий соль антибиотика был пропущен через колонку, ее промывают прибли»» зительно 17 л деионизированной воды.

Вымывание активной части антибиотика, задержанной в колонке, начинают с помощью 0,1 н,раствора гидрата окиси рн бйцентрйрованно о злюата"дово- аммония, подаваемого со скоростью щ около 20 мл в 1 мин. Элюат собирают отдельными фракциями приблизительно по 900 мл, причем каждую Фракцию проверяют на микробиологическую активность. Фракции, содержащие фактор антибиотика 11 объединяют и высуши776566

6,25 (1,56 (1,56

3,12

50 00

Стафилококкус ауреус 3055

Бациллус субтилис

Микобактериум авиум

Стрептококкус фекалис

Лактобациллус казей

I вают из замороженного состояния с целью получения индивидуального высушенного тенебримицина,11.

Пример 4. Получение гелиантата тенебримицина 11.

2 r тенебримицина 11 растворяют в 22 мл воды и .рН раствора доводят до 5 50%-ной серной кислотой. Затем к раствору антибиотика добавляют горячий 10%-ный водный раствор меTHJI-îðàíæà. Гелиантат тенебримицина

11 выделяют в виде осадка, который .отделяют фильтрованием. Твердую соль тщательно промывают горячей водой и высушивают в вакууме. В итоге получают 3,5 r гелиантата тенебримицина 11. l5

Тенебримицин 11 является белым твердым веществом. Электрометрическое титрование в водной среде показывает наличие способных титроваться группировок, имеющих значения рН 2п около 5,7, 6,7; 7,7 и 8,7. Удельное вращение, определяемое в свете линии

0 натрия при температуре 25 С, обусловленное данным фактором, равно

+159о, если концентрация антибиотика

1%, считая на весовое количество, приходящееся на единицу объема в водном растворе.

Тенебримицин 11 имеет следующий состав, Ъ: С 46,47; Н 7,99; и 13,05;

Молекулярный вес по результатам титрования около 539.

Эмпирическая формула С21 Н4 ЙЬО .

Инфракрасный спектр поглощения тенебримицина 11 в среде, содержащей минеральное масло, имеет следующие различные полосы в составе спектров инфракрасного поглощения в пределах от 2 до 15 мкм: 3,02; 3,14;

6 05, 6 23; 7 4; 8 5; 8 75; 9 17.; 40

Тенебримицин 11 образует ацетильное производство, имеющее с около

+130о при концентрации соединения

1%, считая на весовое количество, 45 приходящееся на единицу объема в водном растворе. У производного. не имеется оставшихся группировок, способных титроваться. Элементарный состав, определенный по методу микроорганизма, показывает, что к структуре тенебримицина 11 были присоединены четыре ацетильные группировки.

Соли, являющиеся продуктами присоединения кислот к тенебримицину или отдельным компонентам, входящим в состав антибиотика, можно получить с помощью обычных методов. Для образования соли можно применять или органические или неорганические кислоты. Удобный метод получения таких 6О солей заключается в добавлении раст» вора кислоты, служащей для образования, к водному раствору антибиотика..

В случае нерастворимых солей, являющихся продуктами присоединения кислоты, соль осаждается иэ раствора и легко отделяется с помощью обычных технических приемов, таких как фильтрование или центрйфугирование.В случае, когда желаемая соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, не осаждается с достаточной легкостью, процесс осаждения можно усилить, концентрируя раствор до меньшего объема или добавляя к воде смааивающийся с ней растворитель, такой как ацетон или подобный ему. Соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, можно без труда снова перевести в форму свободного основания путем пропускания водного раствора соли над анионообменной смолой в гидроксильном цикле.

Различные "факторы", образующие тенебримициновый комплекс, можно отличить один от другого, а также от других антибиотиков, обладающих сходными свойствами, с помощью технических приемов бумажной хромато- графии. Хроматографию проводят но обыЧному нисходящему методу при температуре 22,8+0,6 C. Константа миграции для каждого из антибиотиков выражена как константа R, а отличие от более распространенного значения

Rg. Значение константы Ra выражает соотношение между расстоянием, проходимым антибиотиком, по отношению к концу ленты скорее, чем фронт растворителя.

Тенебримицин обладает ингибирующим действием по отношению к росту микроорганизмов, патогенных для жизнедеятельности животных и растений ° Ингибирующие концентрации, при которых проявляется тормозящее действие, приведены в таблице . Минимальные ингибирующие концентрации были определены по методу разбавления агара со свободным основанием.

Острая токсичность тенебримицина

11 отмечается при внутривенном введе-, нии мьмам s дозе около 385 мг/кг.

Новый комплексный антибиотик, соответствующий настоящему изобретению получается в результате культивирования.

11, 776566

Продолжение таблицы

ПРодолжение таблицы

Эрвиния амилофора

Псевдомонас соланацерум

5 Ксантомонас фазеоли

Лейконосток- центрофорум

Эшерихия колн 9 1

Эшерихия коли 9 2

1,56

25,00

12,50

Протеус сп. 9 1

Протеус сп. 9 2

Псевдомонас сп. 9 2 Псевдомойас сп. 9 5

Клебсиелла аэробактер

9 14

12,50

Клебсиелла аэробактер 9 15

Сальмонелла сп. 9 1

Вибрио мечниковии

12,50

25,00

12,50

Arpîáàêòåðèóì тумефациено

25,00

Составитель С. Малютина

Редактор Н.Спиридонова Техред И.Асталош Корректор М.Вигула

Заказ 7798/70 Тираж 522 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент",г. ужгород, ул. Проектная, 4

50, 0

25, 0.0

50,00

100,00

25,00

25,00

12,50—

Предлагаещюй способ позволяет получить новый антйбиотический комплекс генебримицина. формула изобретения

10. Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина, содержащего Фракции тенебримицина 1, 1" н 11, о т л и ч а ю щ и и с .я тем, что, штамм Streptomyces tenebrartus

i5 ATCC 17921 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре

37-43оС в теченйе 4-7 дней, выделяют

20 антибиотический. комплекс в свободном виде или в виде его солей, и/или разделяют на составляющие его фракции.