Способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди-или - трифосфатов

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

IIII 437288

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 07d 51/50 (22) Заявлено 06.05.72 (21) 1781921/23-4 (32) Приоритет 06.05.71 (31) P 2122529.6 (33) ФРГ

Опубликовано 25.07.74, Бюллетень ¹ 27

Государственный комнтет

Совета Мнннстров СССР па делам нэооретеннй н открытий (53) УДК 547.857.7.07 (088.8) Дата опубликования описания 26.12.74 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Фриц Екштейн (ФРГ) и Porep Сидней Гооди (Великобритания) Иностранная фирма

«Макс-Планк-Гезельшафт цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.В«» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИОФОСФАТНЫХ АНАЛОГОВ

НУКЛЕОЗИД-ДИ- ИЛИ -ТРИФОСФАТОВ заключающийся в том, что нуклеозид-5 моно-.или-дифосфат подвергают взаимодействию с хлор ангидридом дифенилфосф орной кислоты и с соединением общей формулы

Il

n.- S- — Р— 0, (П)

0Н

10 где R — группа

11

ХН вЂ” С вЂ” СН -СН, 15

g — 70 (РО ) „— 0

20 в которой  — природное или модифицированное нуклеиновое основание; 25

Х вЂ” водород или окоигруппа; тпи п — 1или2, Изобретение относится к способу получения новых соединений, которые могут найти применение для биохимических исследований.

Известен способ получения нуклеозид-диили-трифосфатов взаимодействием нуклеозид5 -моно-или-дифосфата с фосфорной кислотой и карбодиимидом в присутствии третичного амина.

Применение известного способа привело к получению новых соединений, обладающих ценными свойствами при ферментативных превращениях.

Предлагается способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди- или -трифосфатов общей формулы или НРΠ— з — S —, с последующим отщеплением группы R от продукта реакции и возможным окислением до дисульфида. Продукты выделяют известным способом в свободном виде или в виде соли.

Реакцию нроводят обычно в среде полярного органического растворителя. При этом порядок введения реагирующих веществ в реакцию устанавливают пробой. В этом случае возможно сначала получение P (1) -дифенилР (2) -нуклеозид-5 -пирофосфата, который под437288

3 вергают обработке с $-2-карбамоилэтилфосфатом в среде полярного органического растворителя с последующим омылением в щелочной среде и возможным окислением до дисульфида. Или P (1) -дифенил-P (2) -нуклеозид5 -пирофосфат подвергают взаимодействию с солью дитиофосфорной кислоты в среде полярного растворителя с последующим восстановлением меркаптопроизводным и возможным окислением до дисульфида, Или S-2-карбамоилтиофосфат подвергают обработкехлорангидридом дифенилфосфорной кислоты и полученный продукт реакции приводят во взаимодействие с нуклеозид-5 -дифосфатом с последующим омылением в щелочной среде и возможным окислением до дисульфида.

В качестве полярного органического растворителя обычно берут пиридин.

Как правило, реакцию ведут при 0 — 100 С, предпочтительно при комнатной температуре.

Отщепление группы R от целевого продукта проводят обычно щелочным омылением при нагревании в случае карбамоилэтильной группы или путем восстановления меркаптопроизводным, обычно Р-меркаптоэтанолом, в случае тиофосфорнокислой группы.

При этом исходные соединения, содержащие фосфорнокислые группы, вводят либо в свободной форме, используя полярные органические растворители, образующие соли, либо в виде их солей, растворимых в органических растворителях, предпочтительно в виде солей с третичными аминами.

Окисление целевого продукта до дисульфида, как правило, проводят красной кровяной солью или разбавленной перекисью водорода.

В формуле 1-В- в случае, если это натуральное нуклеиновое основание, представляет аденин, гуанин, гипоксантин, цитозин, урацил, тимин, 5-метилцитозин или 5-оксиметилцитозин. В случае, когда Х вЂ” оксигруппа — это производные нормальных,нуклеотидов, а в случае, когда Х вЂ” водород, то это соответствующие дезоксирибонуклеотиды.

Представителями соединений, полученных по предлагаемому способу, являются аденозин-5 -0- (2-тиодифосфат), гуанозин-5 -0- (2-тиодифат), инозин-5 -0- (2-тиодифосфат), цитидин-5 -0- (2-тидифосфат), уридин-5 -0- (2-тиодифосфат), тимидин-5 -0- (2-тиодифосфат), 5-метилцитидин-5 -0- (2-тиодифосфат), 5-оксиметилцитидин-5 -0- (2-тиодифосфат), аденозин5 -0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, гуанозин-5 0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, инозин-5 -0- (2тиодифосф ат) -дисульфид, цитидин-5 -0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, уридин-5 -0- (2-диодисульфат) -дисульфид, тимидин-5 -0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, аденин-5 -0- (3-тиотрифосфат), гуанозин-5 -0- (З-тиотрифосфат), инозин5 -0- (З-тиотрифосфат), цитидин-5 -0- (3-тиотрифосфат), уридин-5 -0- (З-тиотрифосфат), тимидин-5 -0- (З-тиотрифосфат), аденин-5 -0- (3тиотрифосфат) -дисульфид, инозин-5 -0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид, цитидин-5 -0- (3-тио5

4 трифосфат) -дисульфид, уридин-5 -0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид.

В случае, когда В в приведенной формуле представляет модифицированное нуклеиновое основание, это соединение можно получить заменой одного или нескольких заместителей у ядра природного нуклеинового основания.

Так, можно присоединить к пуриновому или пиримидиновому ядру в различных положениях атом галоида, алкилы, замещенные аминогруппы, сульфгидриды.

Представителями подобных соединений являются, например 1-метил-, 2-метил- или

7-метиладенин, -гуанин, -гипоксантин, -ксантин; З-метил-, N (4) -метилцитозин; 5-бром-, 5-иод-, 5-хлор-урацил; 8-бром, 8-йод, 8-фторгуанин; N (6) -диметиладенин, 1-диметилаллиладенин, 2-аминопурин, 2-кетопурин, 2-тио- или

4-тиоурацил, оротовая кислота, 1-метил- или

З-метилурацил, 5-оксиурацил, 5-гидрометилурацил, моноалкиламино- и диалкиламинопурин и т. п.

Пример 1. В 5 мл высушенного метанола и 0,43 мл (1 ммоля) три-н.октиламина вносят

347 мг (1 ммоль) аденозин-5 -фосфата и смесь слегка нагревают для полного растворения. Затем растворитель отгоняют под вакуумом и остаток несколько раз упаривают досуха с аликвотным количеством по 5 мл сухого диметилформамида. Затем приливают

7 мл сухого диоксана .и, если не происходит растворения, — 1 мл сухого диметилформамида. Затем приливают 0,3 мл хлорангидрида дифенилфосфорной кислоты и 0,3 мл три-н.бутиламина. Образуется белый осадок, который вновь растворяют при перемешивании.

После 3 час выдержки растворитель отгоняют и приливают 50 мл сухого эфира. Смесь оставляют на полчаса при 4 и затем декантируют.

К остатку приливают 5 мл сухого диоксана и полученную суспензию упаривают досуха. Затем приливают раствор $-2-карбамоилэтилтиофосфата в виде соли с три-н.бутиламмонием в 6 мл сухого пиридина. Смесь выдерживают 3 часа при комнатной температуре, при этом образуется осадок. Пиридин отгоняют под вакуумом, приливают 80 мл 0,2 н. едкого натра и полученный мутный раствор нагревают в течение 10 мин до 100 С. Охлаждают смесь и нейтрализуют ее нонообменной смолой Мерк 1 (в пиридиниевой форме), обрабатывают 0 5 мл р-меркаптоэтанола, фильтруют и хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе с применением линейных градиентов триэтиламмонийбикарбонатного буфера. Продукт элюируют при 0,22М. Выход достигает 35 /О в пересчете на аденозин-5 -фосфат. Соединение имеет с пектр аденозина Х„";, 259 ммкм (е 15000).

Пример 2. 1 ммоль (302 мг) дикалийдигидродитиофосфата переводят в соль пиридиния пропусканием через ионообменник

Мерк 1 в пиридиновой форме. К соли пиридиния добавляют 2 ммоля три-н.бутиламина и

437288

5 сушат под вакуумом. Продукт обрабатывают 4 мл сухого пиридина и затем вводят в реакцию по описанному в примере 1 способу вместо $-2-карбамоилэтилтиофосфата. Получение P -дифенил-P -нуклеозида происходит из расчета 0,5 ммоля аденозин-5 -фосфата.

После 16 час выдержки при комнатной температуре растворитель отгоняют под вакуумом, остаток растворяют в 20 мл воды, обрабатывают 2 мл (меркаптоэтанола и очищают на ДЕАЕ-целлюлозе описанным в примере 1 способом. Выход 26% в пересчете на аденозин-5 -фосфат. Продукт идентичен полученному в примере 1.

Пример 3. 05 ммоля литиевой соли S-2карбамоилэтилтиофосфорной кислоты переводят, как описано в примере 2, при помощи ионообменника в соль пиридиния и затем переводят при помощи 0,22 мл (0,5 ммоля) три-,н.октиламина в моно- (три-н.октиламMQнийную) соль. Продукт растворяют в 3,5 мл сухого диоксана и обрабатывают 0,15 мл хлорангидрида дифенилфосфорной кислоты и

0,23 мл три-н.бутиламина. Раствор выдерживают 2 часа при комнатной температуре и затем упаривают под вакуумом. К остатку приливают 10 мл эфира и после кратковременного взбалтывания приливают 20 мл петролейного эфира (перегонка при 40 — 60 ) и смесь оставляют на полчаса при 4 . Декантируют, остаток растворяют в 3 мл сухого диоксана и раствор упаривают под вакуумом. В полученный сироп вносят 0,25 ммоля аденозин-5 -дифосфат - моно- (три-н,октиламмоний) - моно(три-н.бутиламмоний)-ной соли в 3 мл сухого г иридина и раствор оставляют на 2 часа при комнатной температуре. Растворитель отгоняют под вакуумом, приливают 20 мл 2 н. едкого.натра и смесь нагревают 10 мин при 100 .

После охлаждения раствор нейтрализуют с помощью ионообменника, обрабатывают 0,5 мл р-меркаптоэтанола, очищают хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе с применением линейного триэтиламмоний — бикарбонатного буфера, рН 7,5 от 0,15 до 0,4 М. Целевой аденозин-5 0- (3-тиотрифосфат) элюируют при 0,28 М.

Продукт очищают повторной хроматографией на сефадексе ДЕАЕ с концентрацией буфера в интервале 0,35 — 0,6 М (поступающий при

0,5 М). Соединение обнаруживает спектр аденозина Лн,-о, 259 ммкм (е 15 000) .

П р и мер 4. Раствор 1 ммоля, полученного по описанному в примере 1 способу, аденозин5 -0- (тиодифосфата) в воде обрабатывают водным раствором красной кровяной соли и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор переносят на хроматографическую бумагу и при рН 7,5 и

2200 В подвергают электрофоретическому разделению. Аденозин-5 -0- (2-тиодифосфат) -дисульфид элюируют смесью равных объемов метанола и воды. Выход 60%. Соединение обнаруживает спектр аденозина Л",- о 259 ммкм (е 30 000) .

Пример 5. 6 молей аденозин-5 -0-(2-тиодифосфата) и 0,8 мл воды обрабатывают 0,1 мл

3%-ной перекиси водорода и затем упаривают досуха. К остатку приливают 1 мл воды и упаривают. Операцию проделывают трижды для удаления остатков перекиси водорода.

Происходит количественный перевод в дисул ьф ид.

Пример 6. Аденозин-5 -0-(3-тиотрифосфат)

10 переводят описанным в примере 4 способом в аденозин-5 -0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид.

Выход 50%. Спектр аденозина Л"-о 259 ммкм (е 30000).

Пример 7. Аденозин-5 0- (3-тиотрифосфат) переводят описанным в примере 5 способом в аденозин-5 -0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид (т. е. окисляют до дисульфида). Выход 90%.

Повторяют описанные в примерах 1 — 7 операции, заменив производное аденозина соответствующим производным гуанозина, инозина, цитидина, уридина, тимидина, 5-метилцитозина или 5-оксиметилцитозина. Аналогичным образом употребляют соответствующие дезоксипроизводные. Во всех случаях реакции протекают с аналогичными выходами.

Предмет изобретения

1. Способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди-или-трифосфатов общей формулы

0

iI - 8- P — О, (IB

0Н

0

II

14Hg — С вЂ” СН -СН

55 где R — группа или 11РОд — S —, с последующим отщеплением группы R от продукта реакции и выделением целевого продукта, известным способом в свободном виде или в виде соли, или окислением до дисульфида.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что процесс проводят в среде полярного орга65 пичсского растворителя, например пиридина.

40 где  — природное или модифицированног нуклеиновое основание;

Х вЂ” водород или оксигруппа;

m.è п — 1 или 2, отличающийся тем, что нуклеозид-5 моно-или-дифосфат подвергают взаимодействшо с хлорангидридом дифенилфосфорной кислоты и с соединением общей формулы