Способ получения меченных тритиемнуклеози

О П И С А Н И Е 250I47

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соеетслиз

Сониалистическиз

Ресоублии

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №

Кл. 12р, 16

Заявлено 11Л.1968 (№ 1210821/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 12Л 111,1969. Бюллетень № 26

Дата опубликования описания 15.1.1970

МПК С 074

УДК 547.963.32,07 (088.8) Комитет ло делам изобретений и открытий лри Совете Министров

СССР

Авторы изобретения

О. В. Лавров, К. С. Михайлов, H. Ф. Мясоедов, Т. Д. Тельковская и Л. С. Кухаркина

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ

Н УКЛ ЕОЗИД-МОНОФОСФ Т01з, йЛ и Н УКЛ ЕОЗ ИД-ДИФОСФАfOb, иЛи НУю Л ОЗйД- i РiivOСvAТO8

Известен способ получения меченных нуклеозидфосфатов путем выращивания соответствующей оиомассы на среде, содержащеи радиоактивный предшественник,,полученные при этом меченые нуклеиновые кислоты известными способами выделяют и гидролизуют. 11ри этом получают меченыи нуклеозидмонофосфат, который подвергают очистке от продуктов радиолиза, на смоле Дауэкс-!, а затем — ферментативному фосфорилираванию. Таким образом получают меченые нуклеозидди- и трифосфаты. Эта методика трудоемка, ведет к большим потерям дефицитного меченого нуклеозидмонофосфата.

Для упрощения процесса, предложен способ получения меченных тритием нуклеозидмонофосфатов или нуклеозиддифосфатов или нуклеозидтрифосфатов, заключающийся в том, что нуклеозидтрифосфат, нанесенный на инертный носитель, подвергают тритированию газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда при темпе,ратуре 100 — 150 С, полученную,при этом смесь меченных тритием нуклеозидмоно-, дни трифосфатов подвергают обработке формиатом аммония на смоле Дауэкс-1 в формиатной форме. Получают индивидуальные,продукты, которые подвергают концентрированию путем обработки активирова нным углем, а затем раст,вором аммиака.

B качестве нуклеозидтрифосфата можно применять аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат, цитидинтрифосфат, уридинтрифосфат или их дезоксипроизводные.

Пр им ер l. Тритирование про|водят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого, помещают на несенный на стекловату трифосфат. На стекловату наносят

300 мг аденозинтрифосфата (АТФ) . Время тритирования в условиях высокочастотного газового разряда 30 мин. Температура в процессе тритирования 120 — 130 С.

После окончания тритирования вещество смывают со стекловаты водой и далее лабиль ный тритий замещают на водород путем об.мена с .водой и вакуумной отгонки.

В табл. 1,приведены да нные по снятию лабильного трития,при тритировании А 1 Ф (объем, удельная активность и общая активность,при трех, последовательных отгонках воды в пленочном испарителе при давлении

18 мм рт. ст).

Остаток АТФ в колбе после трех отгоно

;растворяют,в 20 смз дистиллированной воды, 2> Разделение нуклеотидов по степени фосфорилирования и очистку от продуктов радиолиза .проводят на колонке длиной 20 см и диаметром 1,2 см, заполненной .смолой Дауэкс 1 >< 8 в формиатной форме с размером частиц смоЗО лы 200/300 меш. Разделяемый раствор поме250147

Т аблица 1

Удельная активность, мл

Общая активность С

Объем, Раствор

11,75

8,39

2,64

0,032

0,108

247

27,3

0,34

5,6

43,5

34,0

97,0

95,0

19,3

Исходный

I отгон

П отгон

I I I отгон

Конечный .

Таблица 2

Удельная активность, mc/ã

Вес, мг

Аденозин

128

21,87

59,5

107,25

Монофосфат

Дифосфат

Трифосфат

Составитель С. Полякова

Редактор Л, Г. Герасимова Техред Л. К. Малова Корректор А. С. Колабин

Заказ 3544/15 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва Я(-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 щают в верхнюю часть колонки, и элюцию ведут градиентом концентрации формиата аммония (от 0 до 1,7 моль/л).

В табл. 2 приведены количества и удельные активности полученных моно-, ди- и трифосфатов аденозина.

Концентрирование аденозинфосфатов осуществляют сорбцией на угле марки «Карборафин». С угля .последние смывают аммиачно-спиртовой смесью и далее лиофильно высу4

IIIHB3IoT. Проверка .радиохимической чистоть1 с,помощью бума жного горизонтального электрофореза |показала электрофоретическую оды ор оды ость,продуктов.

5 На профиле активности имелся только один пик, отвечающий соответствующему нуклеотиду.

Предмет изобретения

Способ получения меченных тритием нуклеозид-монофосфатов, или нуклеозид-дифосфатов, или нуклеозид-трифосфатов, с применением очистки полученных нуклеозид-фосфатов

15 от,продуктов радиолиза на смоле Дауэкс-1, отличающийся тем, что, .с целью упрощения ,процесса, нуклеозид-трифосфат, нанесенный на инертный носитель, подвергают тритирова.нию газообразным тритием в условиях высо20 кочастотного электрического разряда .при температуре 100 — 150, полученную при этом смесь меченных тритием нуклеозид-моно-, дни трифосфатов под вертают обработке формиатом аммония на смоле Дауэкс-1 в формиат25 ной форме с последующим концентрированием,полученных индивидуальных продуктов путем обработки активированным углем, а затем спиртовым .раствором аммиака.

2. С пособ по п. 1, отличающийся тем, что

30 в качестве нуклеозид-трифосфата,используют аденозин-трифосфат, гуанозин-трифосфат, цитиди н-трифосфат, уридин-трифосфат или их дезоксипроизводные.