Способ определения вирусных антигенов

 

Изобретение относится к вирусологии . Цель изобретения - повьппение точности способа. Получают антиглобулиновую сьшоротку против вирусов гриппа и смешивают с сьгаороткой больного . Смесь вьщерживают при 37°С 1 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость раститровьюают в вирусологическом планшете и определяют титр вируса грийпа или его антигенов путем постановки реакции агглютинации куриных эритроцитов. Чувствительность способа повышается в 12 раз.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3866339/28-14, 3925150/28-14 (22) 06.03.85 (46) 15.05.88. Бюл. У 18 (71) Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. акад. Л.В.Громашевского (72) А.Ф.Фролов, Е.А.Ракша, Т.Ф.Нагорнова, С.В.Гаврилов и Ю.П.Галагуза (53 ) 615.373(088.8) (56) Белозеров E.Ñ., Маркова Т.А.

Лабораторное дело, 1982, 11 12, с. 37-39.

ÄÄSUÄÄ 1396059 А 1 (51)4 G 01 N 33/49 (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения — повьппение точности способа. Получают антиглобулиновую сыворотку против вирусов гриппа и смешивают с сывороткой больного . Смесь выдерживают при 37 С

1 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость раститровывают в вирусологическом планшете и определяют титр вируса гриппа или его антигенов путем постановки реакции агглютинации куриных эритроцитов. Чувствительность способа повышается в 12 раз.! 396059 2

Срок введе- Количество вводимого Путь ввения (в днях) препарата дения

0,5 мл полного адъюванта Фрейнда +

+ 0,5 мл сыворотки

О,! мл глобулинов

0,1 мл глобулинов

0,1 мл глобулинов

0,1 мл глобулинов

0,1 мл глобулинов в/к

16

17

22

23 в/м в/в в/в в/м в/в

Изобретение относится к медицин!е, а именно к вирусологии, и может ! быть использовано для выявления циркуляции иммунных комплексов в биолоrè÷åñêèõ жидкостях при вирусных ин5 фекционных болезнях, для диагностики и определения активности инфекционного процесса при вирусном гепатите. 1О

Целью изобретения является повышение точности способа за. счет увели ения чувствительности и специфичЙости и сокращение сроков анализа.

Цель достигается тем, что сыворот- !5 йу крови или другой б лосубстрат инфекционного больного инкубируют со специфической антиглобулиновой сыворотКой против искомого вируса или вирусного антигена и с помощью известных 20 иммунологических реакций — гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, торможения гемагглютинации, преципитайии в геле, встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), иммуноферментного или 25 других методов определяют вирус или вирусный антиген.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Для осуществления 30

Способа вначале получали иммунную ан-. тиглобулиновую сыворотку к антителам, иаправленным против искомого вируса— вируса гриппа или его антигенов.

Для этого берут 100 мл сыворотки

35 корови переболевших гриппом больных„ содержащую высокие титрь." противогриппозных антител (1:320). Затем из,сыворотки методом сульфат-риванолового высаливания выделяют глобулиновую фракцию. К сыворотке добавляют 0,01 р-р NaOH, доводят рН до 7,4. Эту сыворотку по каплям со скоростью 4-8 капель в минуту вносят в 500 мл

0,3%-ный раствор риванола при постоянном помешивании. Соотношение объемов сыворотки и риванола в мл должно составлять 1:5. Смесь в течение 1 ч перемешивают и выдерживают в холодильнике при 4 С в течение 12-16 ч. Выпавший осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют активированный уголь (3-4 rp) до полного обесцвечивания пены. Смесь перемешивают

30 мин и фильтруют. К полученному фильтрату сыворотки при постоянном перемешивании прибавляют со скоростью

10 капель в минуту насыщенный раствор (!!Н ) Sn4 до 45% насыщения, перемешивают в течение 1 ч и охлаждают при 4 С в течение 16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при

3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в дистиллированной воде, раствор диализуют через целлулоидную пленку с диаметром пор 320-720 ммк против 0,15 М раствора NaC1 В процессе диализа объем высоленных глобулинов доводят до 1/10ч. по отношению к объему исходной сыворотки, т,е. до

10 мл.

Полученный препарат — иммуноглобулин против вируса гриппа - характери" зуют по следующим параметрам:

1. Активность противогриппозных антител. Титр в реакции торможения гемагглютинации составляет не менее

1:2560, 2. Количество белка. Препарат содержит не менее 8 мг белка в мл, что составляет 50% по отношению к исходному его количеству в сыворотке крови.

3. Содержание альбуминов. Препарат содержит 0,3 мг/мл альбумина, что не превышает 3,8% по отношению к общему количеству белка в препарате.

Специфическую антиглобулиновую: сыворотку против иммуных противогриппозных глобулинов получают путем им" муниэации кроликов высоленным препаратом по следующей схеме:

/ з

1396059

24 0,1 мл глобулинов в/в

29 0,1 мл глобулинов в/м

30 0,1 мл глобулинов в/в

31 0,1 мл глобулинов в/в

П р и м е ч а н и е: в/к — внутрикожно; в/м— внутримьппечно; в/в - внутривенно.

Через 7 дней после последнего оро- предлагаемого способа в 10,25 раз ка введения препарата проводят забор выше известного, крови, из которой получают сыворотку. >О Пример 3. Определение специПолученная антисыворотка содержит ан- фичности способа. титела против человеческих иммуногло- В сыворотках 156 больных с диагнобулинов к вирусам гриппа, т.е. анти- зом аденовирусная инфекция, паратела против спЕцифических противо-, грипп микоплазменная инфекция, орви

15 гриппозных антител. Титр полученной определяли содержание антигенов вирусыворотки 1:1 28. са гриппа известным способом. И в сыДля определения вирусных антиге- воротках 168 больных с теми же диагнов берут две пробирки с О, 25(0,05)мл нозами — предлагаемым способом. Спеисследуемого биосубстрата (сыворотка цифичность определяли соотношением больного) и в 1 из пробирок вносят количества отрицательных результатов

0,25 (g,05) мл полученной кроличьей в контрольной группе к количеству антиглобулиновой сыворотки в рабочем обследуемых лиц в этой группе, умножен- титре 1:16. В другую пробирку вносят, ное íà 1007. Известный способ обес0 25 (О 05) мл 0 15 M раствора NaC1, ««л 21 отрицательную находку вирусзаб фе енно 0 0 О1 М фосфатным буфе ного антигена, что составляет 3,57

25 13 ром р H 7 0-7 1 (контроль) . Пробирки специфичности, в то вРемЯ как предвыдерживают 6 мин при 37о 3<ТеМ лагаемый — 163, что составило 91

Ф центрифугируют мин при ф 20 и 3000 об/мин спе и ичности. Таким образом, специпи фичность предлагаемого способа при

Надосадочную жидкость отбирают пипеткой и раститровывают в вирусологичес-в и соло„ичес 30 опРеделении антигенов виРУса гРиппа ком планшете, ячейки которого заполв 6,7 раза вьпне известного.

Пример 4. Сыворотку крови реренного конвалесцента М. исследовали на наличие вируса гриппа, находящегося в

7,0-7,1. В этом планшете определяют титр вируса гриппа или его антигенов н и 35 иммУнном комплексе виРУс гРиппа + анпутем постановки реакции агглютинатитело. Известным способом вирус гриппа из сыворотки крови не выявлялся. ции куриных эритроцитов. Так, в контЕго удалось выделить лишь после оброльном материале титр вирусных анработки этой сыворотки антиглобулитигенов составляет 1:2, а в опытном образце, обработанном антиглобулиноантиглобулино- 40 новой сьвоРоткойв ПОЛУченной как оливой сывороткой, санс в примере Для этого сыворота ае ый пособ повышает кУ кРови инкубировали с антиглобУликак минимум, в ли его антиге- 60 мин, после чего этим материалом заления вирусов гриппа или его антиге45 ражали 9-10-дневных куриных эмбрионов нов. введением материала в объеме 0,2 мл

Пример 2. Определение чувст- в аллантоисную полость. Зараженные вительности способа. эмбрионы инкубировали в течение 72 ч

Сыворотки 510 больных гриппом ис- при 33ОС, после чего их охлаждали, следовали на наличие антигенов виру- 50 аллантоисную жидкость отделяли и исса гриппа известным способом и сыво- следовали на наличие вируса гриппа в ротки 712 больных — предлагаемым спо- реакции агглютинации куриных эритрособом. Срцки определения вирусных цитов. Титр вируса в аллаитоиснои антигенов и возраст больных обеих жидкости составляет 1:16. Таким обгрупп обследуемых были идентичными. 55 разом показано, что в исследуемой сьг

Известный способ позволяет выявить воротке больного находился вирус грипантиген лишь в четырех случаях, в па в форме иммунного комплекса. то время как предлагаемый — в 41 слу- Исследованы биосубстраты 356 больчае, Таким образом, чувствительность ных гриппом. Вирус гриппа, находящий1396059 ся в форме иммунногс комплекса, обнаружен в 5,8% случаев.

Пример 5. Способ определения антигенов вируса гепатита В.

При осуществлекии способа получают иммунную антиглобулиновую сыворотку против антител, направленных против

HB>Ag. Для этого из сыворотки крови больных, переболевших вирусным гепати10 том В с высоким титром антител против вируса гепатита В (1:I28), методом сульфат-риванолового высаливания выделяют гамма-глобулиновую фракцию, как в примере 1. Полученным гамма-гло15 булином нммунизируют кролика по схеме, описанной в:примере 1. Через 7 дней после последнего введения препарата проводят забор крови, из которой получают сыворотку. Полученная кроли-20 чья сыворотка содержит антитела против человеческих иммуноглобулинов к антигенам вируса гепатита В, т.е. антитела против специфических антител к HB>Ag, Титр полученной сыворотки

1: 128.

С помощью полу ч енн ой сыв о po тки и о предлагаемому способу определяли антиген вируса гепатита В,, т.е. HB>Ag.

Для этого анализировали сыворотку крови контактного по гепатиту В, у которого клинические симптомы болезни не были зарегистрированы. Уровень .антител к НВ А8 в этой сыворотке составлял 1:2. После испольэования пред:Лагаемого метода с добавлением к исследуемому материалу антиглобулиновой сыворотки титр HB Ag составил 1:256 °

Пример 6, Определение чувствительности способа определения антигена вируса гепатита В.

Сыворотку, полученную от 196 больных вирусным rепатитом, исследовали на наличие НВ5Аа; известным способом, а от 21! больных — предлагаемым спо45 собом. Известный способ позволил выявить в 151 случае HR Ag, что состави" ло 79,2Z в то время как предлагаемый — 160 положительных реакций или

84, 67..

Таким образом, чувствительность предлагаемого способа в 1, 2 раза превышает известный способ.

Пример 7, Определение специфичности способа определения антигена вируса гепатита В.

В сыворотках 121 больного с диагнозом "гепатит А" "кслиэнтериты" определяли содержание HR>Ag известным и предлагаемым способом. Оценку специфичности способа давали по методу, описанному в примере 3, Известный способ обеспечил 57 отрицательных находок, что составляет 47,17 специфичности, в то время как предлагаемый—

119, что составило 91Х специфичности.

Таким образом, специфичность предлагаемого способа при определении

HB> Ag в 2 раза выше известного.

Пример 8. Сыворотку крови реконвалесцента Г. исследовали на наличие HB Ag находящегося в форме иммунного комплекса HR Ag + антитело.

Известным методом исследования выявить.НВ А находящийся в форме иммунного комплекса не удалось. Он определен лишь после обработки этой сыворотки антиглобулиновой сывороткой.

Для этого сыворотку крови инкубировали с антиглобулиновой сывороткой при

37 С в течение 60 мин, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин и определяли НВ Ag. Титр НВ Ag составил 1:16. Таким образом показано, что в исследуемой сыворотке находился

HB>Ag в форме иммунного комплекса.

Предлагаемым способом исследованы сыворотки крови 211 человек: 83 больных острым гепатитом В, 9 — затяжным, 27 — хроническим активным, 14 - хроническим персистирующим, 59 "здоровых" доноров носителей HB Ag. Предлагаемый способ позволяет выявить HB Ag на 3,4337 случаев чаще, чем известный, а у оессимптонных носителей — на 78,57.

Таким образом, предлагаемый способ повышает точность определения вирусных антигенов за счет увеличения чувствительности и специфичности анализа при определении антигенов вируса гриппа и гепатита В, а также дает возможность определить вирусы или пх антигены, входящие в состав иммунных комплексов, в течение 4 ч, в то время как по известному способу на эти исследования необходимо 48 ч.

Формула изобретения

Способ определения вирусных антигенов путем исследования сыворотки крови, о т л и ч а ю m н и с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет увеличения чувствительности и специфичности и сокращения продолжительности анализа, исследуемую сыворотку для образования иммунных комплексов обрабатывают равным объе.7 !396059 8 мом антисыворотки, полученной иммуни- нием комплексов центрифугированием и зацией кроликов антителами человека определением содержания антигена в против вируса, с последующим отделе- надосадочной жидкости.

Составитель Л.Падюков

Редактор М.Бандура Техред M.Õîäàíè÷ Корректор И.Демчик

Заказ 2490/46 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4