Способ определения субпопуляции т-лимфоцитов

 

Изобретение относится к медицине , точнее к исследованию биологических материалов человека и животных иммунологическими методами. Предназначено для клинической иммунологии в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях и в других областях медицины. Цель изобретения - повышение точности способа определения субпопуляции предшественников Т-клеток. Для этого в течение 6 + + 0,25 ч инкубируют Т-лимфоциты крови в присутствии Т-активина. Затем определяют прирост розеткообразующих Т-клеток (ауто-РОК). Прирост ауто-РОК обусловлен дифференцировкой ранних предшественников ауто-РОК в ауторозеткообразующие клетки. О количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-РОК за 6 ч инкубации. о (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G 01 N 33/49

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3999859/28-14 (22) 29.12 ° 85 (46) 07.05.88. Бюл. Ф 17 (71) Институт клинической иммунологии СО АМН СССР (72) А.Л.Лозовацкий, Е.Р.Черных, Г.Ç.Шубинский и В.А.Козлов (53) 615.375(088.8) (56) Immunology Т.- 1979, v. 122, и. 2, р. 686-691. (54). СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИИ

Т-ЛИИФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к исследованию биологических материалов человека и животных иммунологическими методами, Предна„„SU„„1 94138 А1 значено для клинической иммунологии в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях и в других областях медицины. Цель изобретения— повышение точности способа определения субпопуляции предшественников

Т-клеток. Для этого в течение 6 +

+ 0,25 ч инкубируют Т-лимфоциты крови в присутствии Т-активина. Затем определяют прирост роэеткообразующих

Т-клеток (ауто-POK). Прирост ауто-POK обусловлен дифференцировкой ранних предшественников ауто-РОК в аутороэеткообразующие клетки. О количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-Р0К за 6 ч инкубации. @

1394138

Изобретение относится к медицине, la именно к исследованию биологических материалов человека и животных иммунологическими методами, и может быть использовано в клинической иммунологии и других областях медицины в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях.

Целью изобретения является повыше- 10, ние точности способа эа счет определения субпопуляции предшественников Т-клеток.

Способ осуществляется следующим

;образом. 15

Была изучена динамика экспрессии

; рецепторов к аутоэритроцитам в про1 цессе 18-часовой инкубации лимфоцитов в присутствии Т-активина. Для этого

1 выделяли МК периферической крови здо- 20 ровых доноров путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови (5 мл, содержащей 500 ЕД гепарина) в градиенте плотности фиколлаверографина (3 мл, плотность 1,077) при 25

3000 об/мин. Выделение МК в концентрации 5 мл/мл инкубировали в пенициллиновых флаконах в среде РРМ1-1640 (среда 199), дополненной 20%-ной инактивированной прогреванием сыворотки З0 человека IV группы в присутствии Тактивина (1 ЕД/мл) в течение 18 ч при 37 С. Количество ауто-РОК определяли после 1,5; 3; 6; 18 ч инкубации, исходя из заранее определенных интервалов времени, при которых определялись наиболее существенные изменения в количественном содержании ауто-POK. Тест ауторозеткообразования проводили следущим образом:

0,03 мл лимфоцитов (5 млн/мл) смешивали с равным объемом фетальной телячьей сыворотки, инкубировали смесь при 4 С в течение 30 мин и затем добавляли 0,03 мл iX-ной взвеси аутологичных эритроцитов. Далее клеточную смесь центрифугировали 5 мин при

1000 об/мин и инкубировали в течение ночи при 4 С, после чего производили подсчет ауто-POK. Результаты вышеописанных экспериментов показывают, что содержание ауто — POK в процессе 18-часовой инкубации с Т-активином существенно снижается. Однако снижению предшествует статистически значимый подъем, определяемый в 6-часовых культурах.

В следующей серии экспериментов динамику экспрессии рецепторов к аутологичным эритроцитам в процессе

18-часовой инкубации с Т-активином исследовали в популяции лимфоцитов, обогащенных Е-розеткообразующими клетками (Т-лимфоцитами) ° Для этого

0,5 мл МК периферической крови (10 млн/мл) смешивали с О, 1 мл 20Жной взвеси ЭБ в присутствии 157-ной инактивированной и адсорбированной

ЭБ сыворотки доноров IV группы. Клеточную смесь инкубировали i 5 мин при

37 С, центрифугировали 5 мин при

1000 об/мин и вновь инкубировали в течение 1 ч при 4 С. Осадок осторожно ресуспендировали и центрифугировали в течение 20 мин при 1000 об/мин в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077), Находящиеся в осадке с

Т-клетками эритроциты барана после удаления надосадочной жидкости лиэировали гипоосмолярным шоком. После этого оставшиеся Т вЂ клет троекратно отмывали средой 199 и доводипи до концентрации 5 млн/мл.

Сепарирование Т-клетки инкубировали с Т-активином (1 ЕД/мл) в течение

18 ч при 37 С вышеуказанным способом.

Процентное содержание ауто-POK определяли сразу в популяции свежевыделенных Т-клеток и через 1,5, 3, 6, и 18 ч инкубации. Из результатов видно, что 18-часовая инкубация Т-клеток с Т-активином сопровождается значимым снижением содержания аутоPOK беэ достоверно значимого 6-часового прироста, Сопоставляя результаты, можно предположить, что прирост ауто-POK происходит за счет лимфоцитов, не содержащих Т-клеток, т.е. лишенных Е-рецепторов. Действительно, 18-часовая инкубация с Т-активином субпопуляции МК, лишенных Š— POK (не

Т-клетки) сопровождается приростом ауто-POK фиксируемым в интервале от

3 до 6 ч. Отсюда следует, что максимальный прирост ауто-РОК в этом случае наблюдается в 3-часовых культурах и составляет в среднем 5,9 + 2,7Х.

С целью выяснения, чем обусловлен прирост ауто-POK в культурах MK-дифференцировкой незрелых предшественников ауто-РОК или реэкспрессией рецепторов на клетках, уже утративших данный маркер, исследовали динамику экспрессии рецепторов к ауто-эритроци— там в субпопуляции МК, лишенных аутоPOK. Для удаления ауто-POK из популяции МК 0,3 л MK (5 млн/мл) смешива13941 38

Формула изобретения

Способ определения субпопуляции

Т лимфоцитов в периферической крови путем их инкубации в присутствии

Т-активина с последующим определением прироста розеткообразующих Т-клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет определения субпопуляции предшественников Т-клеток, инкубацию проводят в течение 6 + 0,25 ч и определяют прирост ауторозеткообразующих клеток.

Составитель П.Бонарцев

Техред М.Моргеитал Корректор О.Кундрик

Редактор Г. Волкова

Заказ 2215/41

Тираж 847

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 475

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4 ли с равным объемом фетальной телячьей сыворотки и инкубировали 30 мин при 4 С. К клеточной взвеси добавляли 0 3 мл !07.-ной взвеси аутологичУ

5 ных эритроцитов, обработанных предварител ьно нейроминидаэой. Для этого

10Х-ную взвесь троекратно отмытых в среде 199 аутологичных эритроцитов инкубировали в течение 45 мин при

37 С с нейроминидазой в разведении

1:2000. Далее клеточную смесь лимфоцитов фетальной телячьей сыворотки и обработанных нейроминидазой аутологичных эритроцитов центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и помещали в водяную баню при 4 С на 2 ч, после чего осадок осторожно ресуспендиро" вали и центрифугировали в градиенте плотности фиколла — верографина (1,077) 20 в течение 10 мин при 4 С. Лимфоциты интерфазы, не содержащие ауто-POK собирали пастеровской пипеткой и троекратно отмывали средой 199. Полученные таким образом лимфоциты инкуби- 25 ровали в течение 18 ч с Т-активином, определяя количество ауто-POK в те же временные интервалы. Видно, что удаление ауто-POK не отменяет увеличение содержания ауто-РОК. Фиксируемое в этом случае изменение времени прироста обусловлено изменением субпопуляционного состава инкубируемой смеси, являющегося следствием сепарации лимфоцитов.

Таким образом, удаление клеток, 35 уже экспрессирующих рецепторы к аутологичным эритроцитам, не сказывается на исследуемом приросте ауто-POK.

Чтобы окончательно убедиться в

40 том, что прирост ауто-POK обусловлен исключительно дифференцировкай ранних предшественников ауто-POK в ауторозеткообразующие клетки, МК инкуби:ровали в течение 6 ч с Т-активином.

Затем удаляли все ауто-POK и продолжали инкубацию оставшихся клеток с

Т-активином в течение 18 ч. Предшествующая элюминации ауто-POK 6 — часовая инкубация МК с Т-активином преследовала цель стимулировать диффе ренцировку пре-ауто-POK в ауто-POK.

В этом случае последующая инкубация оставшихся лимфоцитов с Т-активином не должна вызывать подъем содержания ауто-POK. Следоват льно, можно утверждать, что выявленный в процессе

6-часовой инкубации прирост ауто-POK обусловлен дифференцировкой неэрельм (Е-негативных) предшественников аутоPOK в ауторозеткообразующие клетки.

Пример. Мононуклеары периферической крови выделяют вышеописанным методом. Процентное содержание ауто-POK определяют в непосредственно свежевыделенных MK и в культурах

МК, инкубированных в течение 6 ч с

Т вЂ” активином. Способы определения содержания ауто-POK и инкубации лимфоцитов также описаны выше. 0 количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-POK за 6 ч инкубации.

Приведенные результаты демонстрируют, что выявленный среди несепарированных NK прирост ауто-POK статистически значим. Содержание незрелых тимусзависимых предшественников составляет около 6,57. Следовательно, налицо повышение точности предложенного метода по сравнению с известным методом (3,5X).