Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы

Имплантат выполнен в виде биоинженерной конструкции, содержащей клеточный компонент и биосовместимую матрицу - носитель. Матрица -носитель является подложкой для прикрепления клеток и выполнена в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм из пористого сшитого желатина с размерами пор 6-22 мкм. На поверхности микрочастиц распределены постнатальные аллогенные или аутологичные энтодермальные клетки человека. В качестве энтодермальных клеток человека используют протоковые секретирующие клетки подчелюстной слюнной железы или паренхимные печеночные клетки-предшественники, с конечной концентрацией клеток не менее чем 5×10⁶ на мл суспензии (или 10-50 клеток на частицу). Благодаря округлой форме микрочастиц имплантат не слипается и легко инъецируется без травмирования тканей. Имплантат создает оптимальные условия для адгезии и пролиферации клеток, крупнопористая структура которого обеспечивает поддержание высокого уровня функциональной активности энтодермальных клеток. Малый срок биодеградации имплантат препятствует образованию фиброзов тканей и способствует лучшей регенерации. Клеточный компонент конструкции способствует стимуляции собственной регенерации тканей пациента за счет паракринного эффекта, приводит к дифференцировке используемых клеток в функционально активные клетки энтодермы и замещению дефекта тканей пациента. Имплантат предназначен для лечения острых и хронических патологий органов энтодермального происхождения, циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, сахарных диабетов и других видов дефектов.

Полезная модель относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к биоинженерным конструкциям, и может быть использована для заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических паренхиматозных заболеваний печени и поджелудочной железы, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, для коррекции уровня инсулина в организме, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.

Создание клеточных имплантатов в виде биоинженерных конструкций для возмещения дисфункции и восстановления дефектов поврежденных тканей печени и поджелудочной железы является одним из самых сложных направлений тканевой инженерии. Известные на сегодняшний день конструкции способны лишь временно улучшать функции паренхимных органов и не позволяют существенным образом влиять на процессы репарации поврежденных тканей. Большую проблему представляет поддержание жизнеспособности и функциональной активности клеточных элементов биоинженерных конструкций в течение длительного времени при хранении и после трансплантации на весь период восстановления дефектной паренхимной ткани собственными клетками пациента. Еще одной проблемой является сложность получения донорского клеточного материала в количестве, достаточном для успешной репарации дефектов после трансплантации.

Известен имплантат для хирургического лечения заболеваний внутренних органов, в частности, для лечения сахарного диабета, который содержит суспензию клеток поджелудочной железы, помещенную в иммуноизолированное вместилище, выполненное в виде сплошного объема сферической или уплощенной формы из пористого никелида титана с поперечным размером пор, не превышающим 0,5 мкм, через которые осуществляется обмен веществ клеточной суспензии, соответствующей заболевшему органу (RU 2143867, A61F 2/02, опубл. 10.01.2000).

Недостатком известного устройства является слабая фиксация клеточной культуры на поверхности никелида титана, что может привести к постепенной обратной диффузии культуры по сквозным каналам ячеек за пределы пористого каркаса и обрастанию каркаса фиброзной тканью, и тем самым к снижению эффективности лечения. Кроме того, имплантат изготавливается из никелида титана, что может привести к развитию онкологических заболеваний.

Известно имплантируемое устройство, которое имеет корпус из матричного материала, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем: (а) множеством клеток млекопитающих и (б) множеством микросфер, каждая из которых состоит в основном из одного или более следующих веществ: коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона или стекла (RU 2201765, А61К 39/00, опубл. 10.04.2003).

Недостатком указанного устройства является трудоемкость в исполнении и низкая биосовместимостъ, что со временем приводит к отторжению имплантата. Кроме того, такая конструкция имплантата не создает условий для прочного прикрепления клеток и сопровождается их потерей при культивировании.

Известен имплантат для лечения инсулинзависимого диабета в виде макрогранулы, сформированной гидрофильным гелем (из агарозы, смеси агарозы и коллагена или агарозы и желатина), внутри которой расположены секреторные клетки, в частности панкреатические островки, и сверху покрытой агарозой (RU 2208636, C12N 11/04, опубл. 20.07.2003).

Однако данная конструкция имплантата не обеспечивает оптимального микроокружения для клеток и не создает условий для клеточного метаболизма и секреции веществ, в следствие чего клетки гибнут от недостатка питательных веществ и кислорода внутри макрогранул. Кроме того, с течением времени макрогранула будет покрываться фиброзной капсулой внутри организма, что повлечет необходимость ее изъятия. Помимо этого существует проблема недостатка донорского материала из панкреатических островков поджелудочной железы.

В патенте RU 2417090 описан имплантат для заместительной терапии диабета в виде макрогранул из агарозы Seakem Gold с диаметром 4-12 мм, содержащий инкапсулированные секреторные клетки, представляющие собой островки поджелудочной железы, и сверху покрытый вторым слоем агарозы толщиной 0.05-5 мм (RU 2417090, A61K 35/39, опубл. 24.04.2011).

Однако конструкция имплантата в виде крупных макрогранул имеет указанные выше недостатки, и кроме того такой имплантат способен лишь частично и временно компенсировать недостаточную функциональность органа и не стимулирует регенерацию собственных тканей пациента.

Известен трансплантат для лечения печеночной недостаточности, включающий трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс, имеющий общий объем не менее 0,05 см³ и наименьший линейный размер не менее 0,2 мм, размеры пор 2-500 мкм, суммарную пористость 50-97%, и посаженные на него аллогенные прогениторные клетки костного мозга и аллогенные клетки печени, причем концентрация клеток печени и костного мозга 2·10⁶-15·10 ⁶ клеток на 1 см³ матрикса и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. В качестве матрикса может быть использован биоматериал, созданный, например, на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) - ЭластоПОБ. Полиоксибутират - гомополимер, синтезируемый различными видами прокариотических клеток. (RU 2425647, А61В 17/00, опубл. 10.08.2011)

Недостатком данного трансплантата является использование аллогенного материала, который со временем элиминируется из организма иммуннойсистемой. Помимо этого, использование донорских прогениторных клеток печени является не оптимальным, так как данные клетки являются мало доступными.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемой полезной модели является клеточный имплантат для замещения дефектов печени и поджелудочной железы, выполненный в виде объемной трехмерной биоинженерной конструкции, включающей гепатоциты, клетки островков Лангерганса и пористую матрицу - носитель со степенью пористости в диапазоне от 93 до 98%, выполненную из биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, выбранных из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(-капролактон) и сложные поли(-гидроксиэфиры). Указанную матрицу получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, при этом от 2 до 4% пор матрицы характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; от 3 до 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; от 15 до 19% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; от 6 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; от 11 до 15% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; от 5 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; от 16 до 20% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм. На поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина (RU 2392287, C08J 9/26, A61L 27/56, опубл. 20.06.2010).

Недостатком ближайшего аналога является сложность изготовления матрицы-носителя. Использование в качестве клеточного компонента гепатоцитов и островков Лангерганса является не оптимальным, так как существует значительный дефицит донорских клеток этого типа.

Задачей при создании полезной модели являлось получение клеточного имплантата для возмещения дисфункции и восстановления дефектов поврежденных тканей печени и поджелудочной железы в виде биоинженерной конструкции с устойчивой пространственной организацией и поверхностной адгезией клеточных элементов, позволяющей поддерживать рост клеток и их функциональную активность в течение длительного времени с использованием легкодоступных клеток, применяемых как в аутологичном, так и аллогенном варианте.

Технический результат полезной модели заключается в упрощении ее изготовления, повышении эффективности лечения путем ускорения заживления дефектов паренхимных органов различной этиологии и тяжести, устранения фиброзных осложнений за счет конструктивных особенностей имплантата, позволяющих сохранить в течение длительного времени жизнеспособность, пролиферативную и функциональную активность клеточного компонента имплантата после трансплантации на весь период восстановления дефектной паренхимной ткани собственными клетками пациента.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, в отличие от всех известных аналогов и ближайшего прототипа, конструктивно выполнен в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм из сшитого желатина с размерами пор 6-22 мкм, включающих легкодоступные клетки: печеночные клетки - предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.

Сущность полезной модели заключается в следующем:

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы представляет собой объемную трехмерную биоинженерную конструкцию, образованную пористой матрицей - носителем и клеточным компонентом. Конструктивно он выполнен в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм из пористого биодеградируемого материала, в частности, пористого сшитого желатина с размерами пор 6-22 мкм, и посаженных на них печеночных клеток - предшественников или протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы человека.

Матрица - носитель, которую также называют подложкой клеток или биоматриксом, выполняет роль трехмерного каркаса и имеет трехмерную проницаемую пористую структуру с порами большого размера (6-22 мкм).

Такая структура носителя повышает прикрепление клеток к поверхности биоматрикса (100% клеток прикрепляются к микрочастицам в течение 24 часов), исключает потерю клеток при культивировании и препятствует вымыванию клеток после трансплантации, что обеспечивает устойчивую пространственную организацию клеточного компонента имплантата с пролонгированием пролиферативной и функциональной активности. Благодаря оптимальным параметрам размеров микрочастиц и пор матрицы - носителя клетки способны проникать внутрь частицы и формировать трехмерные структуры и, кроме того, обеспечивается обмен продуктами клеточного синтеза с микроокружением, а также миграция клеток в окружающие ткани. В результате улучшается функциональное состояние клеток, увеличивается их выживаемость и обеспечиваются оптимальные условия для направленной дифференцировки и стимуляции функциональной активности клеток в течение долгого периода времени без опасности возникновения фиброзов вокруг биоматрикса конструкции.

Выполнение матрицы - носителя в виде микрочастиц округлой или овальной формы также препятствует слипанию при культивировании и уменьшает микротравмирование тканей при введении имплантата в организм пациента.

Кроме того, матрица - носитель из сшитого желатина не цитотоксична, стабильна в растворе в условиях культивирования, по крайней мере, несколько месяцев, сохраняет свою структуру и целостность в условиях культивирования, имеет подходящие размеры для инъекции в паренхимные органы, является биодеградируемой в организме (в течение 1-4 месяцев), а продукты биодеградации также не обладают токсичностью, что особенно важно для активно обновляющихся тканей энтодермы и паренхимных органов.

Клеточный компонент заявленного имплантата может быть аутологичного и/или аллогенного происхождения и представляет собой печеночные клетки-предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека, распределенные на матрице-носителе в количестве не менее чем 5×10⁶ на 1 мл суспензии (или 10-50 клеток на частицу).

Указанные популяции клеток относятся к эпителиальным клеткам энтодермального происхождения, активно пролиферирующим in vitro, что позволяет получить данные клетки в большом количестве. Время удвоения клеточной популяции для клеток слюнной железы составляет 40 часов, для печеночных клеток-предшественников - 60 часов. Клетки могут быть выделены в количестве от 5×10⁵ до 10⁷ с 1 см³ ткани и за 14-30 дней возможно получить достаточное для трансплантации количество клеток (10 ⁸-10⁹). Данные клетки обладают бипотентным потенциалом дифференцировки и могут быть дифференцированы как в гепатоциты, так и в клетки желчных протоков. Клетки слюнной железы, кроме того, активно синтезируют инсулин и могут быть направлены в бета - клетки поджелудочной железы. Клетки экспрессируют гепатоцитарные маркеры: альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератин 19, цитохромы Р450 1А1,2А6 и др. При попадании в 3D условия, клетки начинают синтезировать мочевину, что характерно для зрелых гепатоцитов. Клетки также активно синтезируют широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента. Таким образом, клеточный компонент заявленного имплантата может замещать дефекты тканей и восполнять недостаточность функций гепатоцитов, бета - клеток и других тканей энтодермы. Общими признаками с прототипом являются:

- имплантат включает матрицу - носитель (биоматрикс) и клеточный компонент;

- матрица - носитель выполнена в виде микрочастиц сферической формы из пористого биодеградируемого материала;

- трехмерная пространственная организация клеточного компонента на пористой матрице - носителе.

Полезная модель имеет следующие отличия от прототипа:

- матрица - носитель выполнена из пористого сшитого желатина и имеет размер микрочастиц 130-380 мкм с размером пор 6-22 мкм;

- в качестве клеточного компонента используют печеночные клетки - предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.

Указанные отличительные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Сравнение предлагаемого клеточного имплантата для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы с другими конструкциями имплантатов, известными в области медицины, показало его соответствие критериям полезной модели. Все элементы заявляемого клеточного имплантата являются однозначно идентифицируемыми, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость». При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к клеточному имплантату для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, которым присущи все существенные признаки заявленной полезной модели, что свидетельствует о соответствии критерию «новизна».

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы получают следующим образом:

1. Выделение и культивирование клеток энтодермы.

Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см³ либо кусочек печени размером 0,5-2 см³) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов, ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс.об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см³ ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37 С.

Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1х инсулин-трансферрин-селенит (ITS) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин. при 0,8 тыс. об/мин.

Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f EpCAM, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human EpCAM) в течение 30 минут при 4С, концентрация антител - 1 мкг/10 ⁶ клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами, (конъюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводит магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×10³ клеток на см². Клетки культивируют при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂. После достижения клетками необходимого количества их переносят на матрицу - носитель.

2. Культивирование клеток на матрице - носителе.

Матрицу - носитель из пористого сшитого желатина, имеющую размер микрочастиц 130-380 мкм и размер пор около 20 мкм, например, коммерческий микроноситель CultiSpher-S (HyClone Laboratories, Logan, UT) суспендируют в DPBS без кальция и магния (50 мл на 1 г сухого микроносителя), оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем автоклавируют 15 минут при 121°С для дегазации и стерилизации. Осаждают центрифугированием, удаляют супернатант. Промывают стерильным DPBS 2 раза. Приготовленный таким образом микроноситель может храниться при +4°С 1 месяц. Перед употреблением микроноситель осаждают, удаляют супернатант и добавляют среду культивирования, инкубируют 30 минут при 37°С.

Клетки с пластика снимают трипсином стандартным способом: дважды промывают DPBS, добавляют 0,25% трипсин. Инкубируют при 37°С 5 минут, смывают клетки с культурального пластика средой культивирования в центрифужную пробирку, подсчитывают в камере Горяева, затем осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 300g. Удаляют супернатант и разводят в среде культивирования из расчета 5×10⁵ клеток на 1 мл среды.

Подготовленную суспензию микроносителя осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 5000g, затем удаляют супернатант и добавляют к суспензии клеток в соотношении 10-50 клеток на 1 частицу носителя. Культивируют клетки на микроносителях в роллерной установке при постоянном перемешивании 15-50 RPM.

Продолжительность всего технологического процесса изготовления имплантата составляет 14-30 дней.

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы может быть использован при хронических гепатитах и циррозах печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность 1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов. Инъекции производят по 100 мкл в паренхиму органа (печень или поджелудочная железа) из расчета 10⁶-10⁹ клеток на пациента в зависимости от характера дефекта; либо вводят в селезенку или интраперитонеально, пункционно в большой сальник.

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, представляющий собой объемную трехмерную биоинженерную конструкцию, образованную пористой матрицей-носителем сферической формы и клеточным компонентом, отличающийся тем, что матрица-носитель выполнена из сшитого желатина в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм и размерами пор 6-22 мкм, а в качестве клеточного компонента используют печеночные клетки-предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.