Матрикс для культивирования клеток и наращивания клеточной массы

Полезная модель Биореактор относится к области медицины и биотехнологии, в частности к устройствам для культивирования клеточных линий и может быть использована для наращивания клеточной массы в культуре in vitro. Биореактор представляет собой микрочастицу кремнезема (SiO₂), размером 0,3-0,5 мкм, сформированную из высокоупорядоченных кубических упаковок сферических частиц SiO₂ с размером сфер 250-400 нм и тетраэдрическими и октаэдрическими пустотами между сферами.

Полезная модель относится к области медицины и биотехнологии, в частности к устройствам для культивирования клеточных линий и может быть использована для наращивания клеточной массы в культуре in vitro.

Наращивание клеточной массы в культуре in vitro является необходимым этапом многих исследований. В частности, для доклинических испытаний новых лекарственных препаратов, для испытания воздействия на клетки ряда физических факторов, для биотехнологических и других целей.

Ряд клеточных культур являются адгезивными, то есть формируют монослои в двумерном (2D) пространстве на инертных подложках, выполненных из полистирола, стекла и др. Кинетика роста таких клеточных культур зависит от многих составляющих, в том числе от состава питательной среды, температуры, адгезивных свойств подложки, плотности посева и др. Традиционно в последние 10-летия для культивирования клеток используют культуральные флаконы, многолуночные культуральные планшеты, роллерные бутыли и др. Лимит культивирования в этих условиях составляет 5-7 дней. Указанная ограниченная продолжительность культивирования обусловлена несколькими причинами. Во-первых, ограниченной площадью поверхности культивирования, что ведет к быстрому заселению ее клетками и снижению их пролиферативной активности вследствие контактного торможения. Во-вторых, истощением питательной среды, что также приводит к торможению деления клеток. Две перечисленные выше причины (контактное торможение и истощение питательной среды) требуют периодического рассеивания клеток с использованием новой культуральной посуды и новой питательной среды. Таким образом, наращивание адгезивной клеточной культуры традиционным способом in vitro представляет собой длительную, дорогостоящую многоэтапную манипуляцию.

Известен материал для покрытия культуральной поверхности (полимерного носителя) в виде тонкого слоя оксида кремния (JP 07067618 Base material for cell culture). Покрытие полимерного носителя слоем оксида кремния осуществляют путем вакуумного напыления. Это улучшает условия культивирования и пролиферацию клеток. Техническим результатом известного изобретения является увеличение продолжительности культивирования, равно как и количества наращиваемых за 1 пассаж клеток. Однако суммарная продолжительность культивирования (длительность пассажа до рассева клеток, замены посуды и среды) ограничена возникающим контактным торможением при заселении 2D-поверхности.

Известен также аппарат для выращивания клеток в культуре (культивирования), включающий минимальную порцию (слой) субстрата, покрытого коллоидной кремниевой пленкой (ЕР 0853664 WO 1997/012966 Colloidal silica films for cell culture). Характеристиками пленки в сухом виде являются: толщина около 50 нм, гомогенность, значительная площадь поверхности, пористость, нерастрескивание, смачиваемость, отрицательный заряд, радиационная стабильность. Авторы известного изобретения предлагают наносить на традиционно используемую культуральную поверхность тонкую (<100nm) пленку из коллоидного аморфного силикона, которая обеспечивает хорошую смачиваемость и адгезивность для клеточных культур, и, как следствие, высокую скорость их роста, более длительный рост культур (до контактного торможения) благодаря развитой поверхности. В то же время такую пленку нельзя отнести к полностью биоинертным материалам, так как она содержит биоактивные группы Si-OH. Кроме того, сами авторы отмечают, что пленка частично растворима в культуральной среде (неконтролируемый процесс), что ведет к обогащению микроокружения клеток кремнием (Si). Далее, следует отметить, что, несмотря на развитую поверхность пленки, культивирование клеток происходит в 2D пространстве и, таким образом, его продолжительность ограничивается контактным торможением, что требует замены культуральной посуды и среды культивирования.

Наиболее близким по своей сути устройством - прототипом заявляемой полезной модели является микроноситель для клеточных культур (Microcarrier for cell culture ЕР 0245338 WO 1987/002703), состоящий из микрочастиц кремнезема (SiO₂) или алюмосиликата, величиной 5-15 мкм, спеченных друг с другом при t°900°C в более крупные микрочастицы (агрегаты), размером 125-250 мкм. Таким образом, крупные микрочастицы содержат от 30 до 110 более мелких микрочастиц. Такие микрочастицы (агрегаты) авторы известного устройства предлагают использовать в качестве поверхности для роста клеток в объеме (3D) питательной среды. В зависимости от целей исследования спеченные частицы предлагается покрывать разными полимерами: агаром, альгинатом, декстраном, желатином, гликогеном, пектином, хитозаном, деацетилированным хитозаном. Предполагается, что толщина слоя полимера на поверхности микрочастиц должна быть в пределах 1-30 молекул. Предпочтительно использовать нерастворимые полимеры с 1OН^- и 1NH ₃⁺ группами. Однако устройство, принятое в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, препятствующих достижению технических результатов, присущих заявляемому устройству. Прежде всего, это иррегулярность структуры и формы мелких микрочастиц (5-15 мкм), из которых спечены более крупные микрочастицы (агрегаты), то есть нестандартизованность их структуры и формы. Это же относится и к спеченным из микрочастиц агрегатам. Кроме того, процесс спекания частиц при 900°С ведет к остеклению их поверхности, следствием чего является формирование плотной иррегулярной упаковки микрочастиц с относительно гладкой (неразвитой) поверхностью. Хотя авторы отмечают, что на агрегатах микрочастиц встречаются щели и выемки, однако, высокая плотность агрегатов подтверждается и самими авторами: 1,1-1,6, то есть варьирует в широких пределах и своем верхнем пределе (1,6) существенно выше, чем у H₂O. Это приводит к тому, что агрегаты образуют плотный слой на дне культуральной посуды, что препятствует эффективному всестороннему заселению этих микрочастиц клетками.

Заявляемая полезная модель направлена на решение задачи создания оптимальных условий культивирования и размножения клеточной массы.

Использование в фармацевтической промышленности заявляемого устройства позволяет достичь нескольких технических результатов:

- возможность создания условий, аналогичных условиям роста клеток в организме за счет наращивания клеточной массы в 3D-пространстве;

- возможность избежать модификации и трансформации наращиваемых клеток за счет использования для адгезии биоинертного материала;

- возможность осуществлять процесс наращивания клеточной массы без перепассирования за счет добавления дополнительных микрочастиц SiO₂ и пополнения питательной среды без замены культуральной посуды и/или замены использованной питательной среды в культуральной посуде на свежую.

Указанные технические результаты при осуществлении полезной модели достигаются за счет того, что также как известное устройство - матрикс для культивирования клеток и наращивания клеточной массы состоит из микрочастиц кремнезема (SiO₂). Особенность заявляемого устройства заключается в том, что матрикс представляет собой микрочастицу кремнезема (SiO₂), размером 0,3-0,5 мкм, сформированную из высокоупорядоченных кубических упаковок сферических частиц SiO₂ с размером сфер 250-400 нм и тетраэдрическими и октаэдрическими пустотами между сферами.

Сущность полезной модели заключается в следующем.

2D-адгезивные клеточные культуры нельзя считать полными аналогами роста подобных клеток в организме, поскольку в процессе формирования ткани клетки растут, существуют и делятся в 3D-пространстве, что обусловлено генетически.

В основе заявляемого устройства лежит использование для наращивания клеточной массы микрочастиц (агрегатов), состоящих из высокоупорядоченных кубически упакованных наносфер SiO₂ диаметром 250-400 нм и нанопор 150-300 нм (Фото 1 растровая электронная микроскопия)

На Фото 2 (а-г) представлено строение поверхности агрегата (матрикса) различной степени увеличения. Фото 2а и 2б получены с помощью растровой электронной микроскопии, фото 2б представляет собой увеличение участка, выделенного на фото 1, с указанием диаметров наносфер. Фото 2в представляет собой электронно-микроскопический снимок (реплика), 2г - снимок в атомно-силовом микроскопе.

В плотнейшей упаковке сферы SiO₂ образуют тетраэдрические и октаэдрические пустоты (по числу сфер, формирующих пустоту). Каждую сферу SiO₂ окружает по 6 октаэдрических (диаметром ~78 нм) и 8 тетраэдрических (диаметром ~44 нм) пустот. Таким образом, наносферы SiO₂ образуют матрицу, в которой пустоты между частицами SiO₂ играют роль каналов для подачи питательной среды к клеткам. Схемы расположения октаэдрических и тетраэдрических пустот, образованных сферами SiO₂ представлены на Фиг.1.

Использование для адгезии клеток и наращивания клеточной массы биоинертного материала - микрочастиц, состоящих из кубически упакованных наносфер SiO ₂, позволяет избежать модифицирования и трансформации культивируемых клеток, что характерно для 2D-адгезивных клеточных культур.

Микроскопическое исследование роста культивируемых клеток с использованием микрочастиц, состоящих из кубически упакованных наносфер SiO₂ (матриксов), показало, что в динамике культивирования происходит образование двухфазных систем в виде шарообразных агломератов, состоящих из частиц SiO₂ и клеток. Размер указанных агломератов составляет 4-6 µм, агломераты со временем увеличиваются в размерах, достигая на 14-21-е сутки нескольких миллиметров в диаметре На Фото 3 представлена структура шарообразного агломерата (сфероида), сформированного из микрочастиц SiO₂ и клеток фибробластов человека, окрашенных гематоксилином-эозином (увеличение X100).

По мере формирования сфероидов, имеющих 3D-структуру, возникает возможность пополнять культуральную посуду микрочастицами SiO ₂, а также пополнять или заменять использованную питательную среду в культуральной посуде на свежую, увеличивая тем самым объем, в котором клетки культивируются и формируют сфероиды, продолжать процесс наращивания клеточной массы без их перепассирования. Замена среды в культуральной посуде и добавление новых микрочастиц SiO₂ позволяет продолжать наращивать клеточную массу до тех пор, пока весь объем культуральной посуды не будет занят сфероидами.

Особенности строения структуры «матрикс - адгезивная культура клеток» in vitro, a также оценка адгезивных свойств, острой цитотоксичности матриксов и динамика нарастания на них клеток были изучены на модели иммортализованных фибробластов человека (ФЧ, клон 1608, Медико-генетический научный центр РАМН).

В экспериментах были использованы микрочастицы из кубически упакованных наносфер SiO₂ разных размеров (от 0,2 до 1,0 мм), полученные путем спекания при температурах от 120° до 790°С.

В результате эксперимента установлено, что наилучшими для культивирования клеток являются микрочастицы из кубических упаковок SiO₂ размером 0,3-0,5 мкм, полученные при температуре 300°С. Это подтверждается и макроскопическим исследованием роста ФЧ на опаловых частицах разных размеров На Фото 4 отражено спонтанное формирование 3D-клеточно-опаловых сфероидов из микрочастиц SiO₂, сформированных из кубически упакованных наносфер SiO₂ и фибробластов человека (увеличение ×16 и ×100). ФЧ образуют скопления вокруг более мелких частиц и в меньшей мере заселяют более крупные. Исследование динамики роста ФЧ (до 14 суток) показало, что прирост ФЧ на микрочастицах выбранного размера превышает таковой в контроле (на полистерене) на всех сроках культивирования на 50-70%, что и обеспечивает возможность более быстрого и интенсивного наращивания клеточной массы.

Пример выполнения.

Для получения матриксов требуемого размера массивные (величиной несколько десятков см) образцы кубически упакованных наносфер SiO₂, полученные при t 300°С дробили и с использованием сит выделяли фракции величиной 300-500 мкм которые далее использовали в работе. Перед началом исследований образцы частиц матриксов тщательно (до 6 раз) отмывали в дистиллированной воде в объеме 50 мл/г с последующим их спонтанным осаждением и высушиванием при 150°С. Данную операцию повторяли дважды, далее образцы стерилизовали в сухожаровом шкафу 120 мин при 160°С.

Исследование роста клеток на опаловых матриксах осуществляли в 24-х луночных культуральных планшетах (Costar, США). При проведении экспериментов в планшеты помещали заранее подготовленные стерильные образцы частиц матриксов (200 мг на лунку) и вносили по 1 мл ростовой среды до полного их насыщения культуральной жидкостью (не менее 4-х часов инкубации при 37°С в стерильных условиях). Разобщение клеток сфероидов производят традиционными методами, в частности, трипсинизацией.

Устройство - матрикс для культивирования клеток и наращивания клеточной массы, состоящий из микрочастиц кремнезема (SiO ₂), отличающийся тем, что матрикс представляет собой микрочастицу кремнезема (SiO₂), размером 0,3-0,5 мкм, сформированную из высокоупорядоченных кубических упаковок сферических частиц SiO₂ с размером сфер 250-400 нм и тетраэдрическими и октаэдрическими пустотами между сферами.