Диагностическая тест-система в формате иммуночипа и способ серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза

Настоящее изобретение относится к диагностической тест-системе в формате иммуночипа (биологического чипа) и способу серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза и может быть использовано в области клинической лабораторной диагностики, биотехнологии и медицины.

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики, биотехнологии и медицины, в частности, к диагностической тест-системе в формате иммуночипа (биологического чипа) и способу серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза.

Уровень техники

Лайм-боррелиоз (ЛБ), болезнь Лайма, или клещевой иксодовый боррелиоз (ИКБ) - трансмиссивное полисистемное заболевание, приводящее к поражению опорно-двигательного аппарата, нервной и сердечно-сосудистой систем, кожи, занимающее по широте распространения и уровню заболеваемости одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Природные очаги Лайм-боррелиоза имеют широкое распространение в Северной Америке, Европе и Азии, и приурочены, главным образом, к лесным ландшафтам умеренного климатического пояса. Заболевание регистрируется на значительной территории Российской Федерации. Благодаря относительно высокому уровню заболеваемости (по сравнению с другими природно-очаговыми трансмиссивными инфекциями) и нередко тяжелому течению, ЛБ представляет собой одну из актуальных проблем современной инфекционной патологии в России.

Возбудитель клещевого боррелиоза - комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato, переносчики - иксодовые клещи. В настоящее время выделено более 10 геномных групп, относящихся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato, которые неравномерно распределены по земному шару. Доказана патогенная роль трех геновидов боррелий из группы В.burgdorferi sensu lato (B.burgdorferi sensustricto, B.garinii, B.afzelii) в возникновении у человека заболевания. Геновиды B.lusitaniae, B.valaisiana, B.miyamotoi имеют веские основания дополнить этот список. Следует отметить, что все эти геновиды имеют распространение на территории России. Удельный вес каждого геновида в эпидемиологии клещевых боррелиозов в географических регионах различен. Возможно одновременное заражение разными геновидами боррелий, что приводит к своеобразной клинической картине заболевания, отличной от моноинфекции (боррелиозная микст-инфекция). Наблюдаемые различия в клинической картине течения болезни Лайма у больных в различных точках нозоареала этой инфекции могут иметь в своей основе генетическую гетерогенность комплекса В. burgdorferi sensu lato.

Диагностику ЛБ обычно проводят на основании эпидемиологического анамнеза (посещение леса, присасывание клеща), а также клинических проявлений заболевания, главным из которых, является кольцевая мигрирующая эритема. Однако до 45% случаев ЛБ протекает в безэритемной форме, а у части больных мигрирующая эритема остается незамеченной. Клиническая диагностика безэритемных форм ЛБ представляет значительные трудности и возможна, как правило, только на более поздних стадиях, когда заболевание начинает проявляться в виде какого-либо синдрома органного поражения.

Наличие инфекции выявляют с помощью лабораторных методов, которые можно условно разделить на 2 группы:

1. прямые методы обнаружения боррелий, их антигенов или нуклеиновых кислот в биологических пробах обследуемого человека (кровь, ликвор, синовиальная жидкость, биоптаты), например, методом ПЦР;

2. серологические методы - определение в биологических жидкостях пациентов специфических антител к антигенам В. burgdorferi.

Метод ПЦР с успехом используется для определения зараженности боррелиями клещей, однако анализ с ее помощью различных биологических проб больных ЛБ не дает достоверных результатов. В настоящее время ПЦР не рекомендуется использовать в качестве самостоятельного скринингового теста, непригоден этот метод и для оценки эффективности проведенной антибиотикотерапии. Иногда ПЦР применяют для дополнительного обследования пациента с клиническими признаками ЛБ, но с отрицательным или сомнительным результатом серологических тестов. Однако и в этих случаях отрицательный результат определения нуклеиновых кислот В. burgdorferi в образцах биоптата, синовиальной или спинномозговой жидкостей не доказывает отсутствия у обследуемого пациента боррелиозной инфекции.

Наиболее распространенными методами серодиагностики при ИКБ являются иммуноферментный анализ (ИФА), иммунный блоттинг, иммунофлуоресцентный метод (РНИФ, реакция непрямой иммунофлуоресценции). В 1994-1995 годах в США и странах Европы для повышения надежности серодиагностики боррелиоза было рекомендовано использовать двухступенчатую схему тестирования сывороток крови/спинномозговой и/или синовиальной жидкости. На первой ступени с помощью РНИФ (а чаще, ИФА) проводят скрининговые исследования сывороток пациентов с подозрением на боррелиоз, на второй - образцы, давшие при скрининге положительные или сомнительные результаты, повторно тестируют методом иммуноблота, который по специфичности превосходит эти методы. По результатам иммуноблота, анализируя спектр имеющихся специфических антител к конкретным белкам боррелий, можно косвенно судить о стадии развития заболевания (ранние или поздние проявления ЛБ), а также о повторном заболевании или его рецидиве в пределах одного эпидсезона.

У 60-90% больных с поражениями центральной нервной системы при ЛБ специфические антитела могут определяться также в ликворе, однако их обнаружение не является решающим фактором для подтверждения боррелиозного поражения центральной нервной системы, поскольку антитела могут проникать в субарахноидальное пространство из крови. Иммуноблот для этих целей может использоваться в случаях, когда наблюдается выравнивание концентраций специфических антител в ликворе и сыворотке крови. Определение широкого спектра антител в ликворе, специфичных к разным белкам боррелий, при отсутствии некоторых из них при исследовании сыворотки крови свидетельствует о преимущественно интратекальном синтезе антител.

В иммуноблоте для анализа используют нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны, на которые перенесены разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле белки клеточного лизата В. burgdorferi. При этом, в зависимости от используемого конъюгата, можно определять в тестируемых сыворотках IgM, IgG или суммарные антитела к большому числу белков боррелий одновременно. С помощью блота имеется возможность выявить специфические антитела к определенным белкам боррелий, исследовать динамику наработки антител к различным диагностически значимым белкам, что позволяет клиницистам прогнозировать течение болезни. Гуморальный иммунный ответ человека на боррелиозную инфекцию может быть представлен антителами более чем к двадцати антигенам В. burgdorferi.

Учитывая, что состав белков-антигенов и их соотношение могут значительно отличаться не только среди боррелий разных геновидов (у которых гетерогенность ряда поверхностных белков достигает 40%), а в процессе развития инфекции у В. burgdorferi значительно изменяется уровень экспрессии некоторых иммунодоминантных липопротеинов, спектр антител у инфицированных пациентов может варьировать в зависимости от геновида возбудителя, а также у одного больного на разных стадиях заболевания ЛБ. Так, зачастую на I стадии ЛБ в организме больных появляются иммуноглобулины класса М против флагеллина, OspC. Выявление одновременно широкого спектра антител к антигенам (p100, p75, Oms66/p66, OspA, BmpA/p39, p18, р21) позволяет сделать заключение о достаточно продолжительном периоде времени, прошедшим с момента инфицирования (даже в случаях бессимптомного течения заболевания). Следует отметить, что обнаружение в крови обследуемых пациентов антител к В. burgdorferi не обязательно сопровождается клинической манифестацией ЛБ, и наоборот - у 30% больных боррелиозом с кольцевой мигрирующей эритемой специфические IgM на первой стадии ЛБ могут не определяться. При нейроборрелиозах в 80% случаев антитела в спинномозговой жидкости больных появляются через 2 недели после укуса клеща, и в 100% случаев - после 7 недель. При этом тест на наличие антител в крови больного может быть отрицательным. По мере развития заболевания расширяется спектр антител человека к антигенам возбудителя, IgG на II стадии ЛБ (прогрессирующая, диссеминированная) продуцируются как к флагеллину, OspC и VlsE, так и новым: р39, р58, р60, р66, р75. Следует отметить, что у некоторых больных IgM к белку OspC могут определяться в крови в течение нескольких месяцев. На III стадии боррелиоза (хронизация) иммунный ответ характеризуется еще более широким спектром специфичности продуцируемых антител. В этот период более 80% синтезируемых иммуноглобулинов класса G реагируют с белками р83/100, р58, р43, р39, р30, р21, Osp17 и р14. Вместе с тем, антитела к белку OspC обнаруживают очень редко, поскольку экспрессия этого липопротеина при хронизации заболевания значительно снижена. Установлено, что если на ранней стадии ЛБ пациентам, у которых антитела к В. burgdorferi отсутствуют (или определяются в низкой концентрации), был проведен эффективный курс лечения антибиотиками, то уровень антител у них впоследствии не возрастает. Однако если антибиотикотерапия проведена больным ЛБ с положительными результатами серологических тестов, то концентрация специфических антител после лечения у них может оставаться на детектируемом уровне в течение длительного времени (от нескольких месяцев до нескольких лет). Показано, что антитела к В. burgdorferi у больных нейроборрелиозом продолжают определяться в спинномозговой жидкости в течение года после успешно проведенного лечения. В случаях, когда после проведенного лечения и выписки пациента из стационара, у него вновь выявляются признаки ЛБ, на фоне повышенного содержания IgM и IgG (к флагеллину), то это следует расценивать как случаи повторного заражения.

Использование диагностических тест-систем, основу которых составляет ограниченный набор антигенов, может привести к ситуации, когда отрицательный результат исследования обусловлен тем, что иммунная система человека просто не продуцирует против этих антигенов специфические антитела, поскольку у боррелий, персистирующих в организме человека эти белки отсутствуют. Усилия многих научно-исследовательских лабораторий и компаний, специализирующихся в выпуске диагностических средств, направлены на совершенствование методов диагностики ЛБ. С этой целью ведутся интенсивные исследования по подбору оптимального состава белков В. Burgdorferi, используемых для ИФА, поиску новых иммунологически значимых антигенов боррелий, изучению их главных антигенных детерминант. В иммунном блоте, как правило, спектр антиген представлен наиболее широко по сравнению с иммуноферментными тест-системами. Более того, каждый антиген иммобилизован индивидуально, а не в смеси, что зачастую повышает чувствительность и специфичность теста в целом, т.к. сводиться к минимуму эффект десорбции, частичного перекрывания важных эпитопов белков.

В силу особенностей иммунного ответа при ЛБ эффективность выявления антител к В. burgdorferi у больных даже с применением комбинации современных серологических тестов значительно варьирует в зависимости от стадии заболевания. Так, на ранней стадии заболевания удается выявить до 50% больных боррелиозом, на II стадии - 70-90%, и только на III стадии - до 100%. Поскольку отрицательный результат серологических тестов на ранних стадиях заболевания не является доказательством отсутствия инфекции, для пациентов с подозрением на ЛБ анализ на наличие антител к В. burgdorferi рекомендуется повторить через 2-4 недели со свежим образцом. При обнаружении специфических антител результат серодиагностики оценивается как положительный, подтверждающий боррелиозную инфекцию.

Дифференциальное определение антител по классам является важным в диагностике боррелиоза. Как правило, IgG-антитела появляются в срок от нескольких недель до месяцев после инфекции. В ранней стадии инфекции они часто не обнаруживаются. В этом случае повторный образец должен быть проверен некоторое время спустя. Пациенты во 2-ой или 3-ей стадии болезни обычно дают положительный результат анализа на IgG-антитела. IgM-антитела обычно появляются спустя 2-3 недели с начала болезни. Титр антител часто снижается в течение от нескольких недель до месяцев после выздоровления. Также возможно, что титр антител остается постоянным до нескольких лет. Важным условием серологического обнаружения антител является нормальный иммунный статус и способность иммунной системы. Отдельные случаи серонегативного Лайм-боррелиоза у больных с прогрессирующим течением заболевания и определенными клиническими проявлениями боррелиоза обусловлена во многом состоянием иммуносупрессии этих пациентов.

Таким образом, из всех существующих к настоящему времени серологических диагностических тестов, только иммуноблот обладает наибольшей информативностью, т.к. позволяет определять спектр антител к значимым антигенам. Например, в US 2006281139 A1 (VIRAMEDBIOTECHAG) 14.12.2006 раскрываются наборы для диагностики боррелиоза иммунным блоттингом.

Однако применение иммуноблота далеко не полностью решает проблемы серодиагностики ЛБ, так как:

- оценка результатов проводится зачастую визуально, поэтому она субъективна и зависит от квалификации персонала лаборатории;

- критерии оценки результатов иммуноблота сложны, они отличаются в США, где циркулирует только один геновид В. burgdorferi sensu stricto, и Европе, где доминируют более гетерогенные по антигенам геновиды В. afzelii и В. garinii, а для изготовления наборов фирмы-производители используют различные штаммы боррелий;

- нет возможности на одном стрипе одновременно и раздельно определить спектр антител по классам,

- применение иммуноблота значительно повышает стоимость серологического анализа.

Наиболее близким к настоящему изобретению является патентная заявка «Borrelia burgdorferi cell envelope protein array» (WO 2009/131665 A1(RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK) 2009.10б29) (прототип). В указанном документе предложен способ определения наличия антител к белкам Borrelia burgdorferi, а также способ диагностики болезни Лайма. Предложенный способ осуществляется при использовании чипов.

Однако предложенный белковый чип не позволяет на одном иммуносорбенте в одном эррее и споте одновременно выявлять специфические антитела разных классов - G (IgG) и M(IgM), что достигается в настоящем изобретении при использовании конъюгата, состоящего из смеси вторичных антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированными двумя различными по спектральным характеристикам флуорофоровыми красителями.

Хотя в примере WO 2009/131665 на стр.8 и указывается о применении конъюгированных с флуорофорами антител, а именно козьих антител к иммуноглобулинам человека IgG/IgM/IgA, конъюгированных сСу5, и козьих антител к иммуноглобулинам мыши IgG, конъюгированных Су3, однако, такой конъюгат с Су5 позволяет определить суммарные IgG/IgM/IgA-антитела и не предназначен для дифференциальной диагностики IgG и IgM, как это предложено в настоящем изобретении. А второй конъюгат с Су3 используют для подсчета соотношения интенсивности Су5/ интенсивности Су3 (белок/His-Tag) для каждого белка, которую используют для оценки интенсивности каждого из исследуемых антигенов.

Таким образом, технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала диагностических средств нового поколения, предназначенных для дифференциального выявления спектра антител G и М к спектру антигенов возбудителя боррелиоза для высокоточной, более информативной и специфической диагностики ИКБ на разных стадиях заболевания. Технический результат заключается в создании диагностической тест-системы в формате иммуночипа и в реализации указанного назначения тест-системы для одновременного и дифференциального выявления спектра антител к диагностически значимым иммуногенным белкам боррелий классов G (IgG) и М (IgM), что подтверждается материалами настоящей заявки.

Раскрытие изобретения

В рамках настоящего изобретения используются следующие термины:

биочип - диагностическая тест-система, включающая иммуносорбент, представляющего собой небольшого размера матрицу (слайд, дно лунки планшета, стрип) с набором иммобилизованных в виде индивидуальных микроточек или слотов (от англ. spot - пятно) диаметром от 10 до 500 микрон образцами биологически активных веществ (олигонуклеотидов, антигенов, антител, ферментов, аллергенов и т.д.) и все необходимые реагенты для проведения комплексного серологического анализа (иммуномикрочип) или гибридизационного анализа (ДНК-чип).

иммобилизация - процесс необратимой «пришивки» биологически активных веществ (антигенов, антител, аллергенов и т.п.) на поверхность твердой фазы (иммунологический планшет, стеклянный слайд, мембранный стрип и т.п.).

иммуносорбент (в формате чипа) - сорбент (слайд с активированной химическими группами или их производными поверхностью, иммунологический планшет, стрипы) с иммобилизованными в результате сорбции на нем функциональными биологическими молекулами (антигенами, антителами, олигонуклеотдами и т.п.)

эррей (от англ. array) - ограниченная зона на иммуносорбенте в виде слайде, предназначенная для постановки одного анализируемого образца, является аналогом лунки иммунологического планшета для ИФА или стрипа в иммунном блоттинге. Внутри каждого эррея находится необходимый набор антигенов, внутренних контролей, маркеров для печати.

спот - место иммобилизации антигенов/антител/олигонуклеотида или любого другого биологического материала на эррее.

Все указанные термины, в принципе, известны специалисту в данной области и приведены здесь с поясняющей целью для лучшего понимания сущности предложенного изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением предложена диагностическая тест-система в формате иммуночипа и способ серологической дифференциальной диагностики иксодового клещевого боррелиоза.

Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической дифференциальной диагностики боррелиоза состоит из иммуносорбента с иммобилизованными на нем раздельно антигенами и/или синтетическими пептидами, относящимися к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato, конъюгата и реактивов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело.

На иммуносорбенте дополнительно иммобилизованы вспомогательные контроли. Вспомогательные контроли представляют собой антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека и/или иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека и/или внутренний отрицательный контроль и/или маркеры границ эрреев.

Иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

Иммуносорбент, выполненный в виде слайда, разделен на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца.

Иммуносорбент может представлять собой иммунологический планшет, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца.

В качестве реагентов, необходимых для проведения и валидации анализа, диагностическая тест-система может содержать реагенты для выявления комплекса антиген-антитело, например такие, как растворы для разведения контрольных и исследуемых образцов, раствор для разведения конъюгата, раствор для промывки иммуносорбента, положительный контрольный образец (К+), отрицательный контрольный образец (К-).

Способ серологической дифференциальной диагностики боррелиоза осуществляется с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа, по которому на иммуносорбент с иммобилизованными на нем раздельно антигенами, вносят раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, вносят контрольные и исследуемые образцы, после чего проводят инкубирование полученной смеси при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин для образования комплекса антиген-антитело, иммуносорбент промывают, далее на иммуносорбент вносят раствор конъюгата из смеси антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных различными по спектральным характеристикам флуорофорами, и проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин, иммуносорбент промывают, высушивают, после чего проводят детекцию образовавшегося комплекса антиген-антитело.

Выявление антител к определенным антигенам проводят, исходя из оценки интенсивности сигналов флуоресценции в местах локализации того или иного антигена на иммуносорбенте.

Дифференциальное выявление антител различных классов проводят благодаря использованию конъюгата, состоящего из смеси антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных соответственно различными по спектральным характеристикам флуорофорами, и учету результатов с помощью многоканального флуоресцентного сканера при активации соответствующих каналов.

Диагностическая тест-система содержит иммуносорбент с иммобизованными на нем раздельно диагностически значимыми антигенами и/или пептидами, относящимися к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato, конъюгат и реагенты, необходимые для выявления комплекса антиген-антитело. На иммуносорбенте могут быть дополнительно иммобилизованы внутренние контроли.

В качестве реагентов для выявления комплекса антиген-антитело могут быть использованы:

- раствор для разведения исследуемых и контрольных образцов (например, 1% раствор казеина и 2% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере),

- раствор для разведения конъюгата (например, 1% раствор казеина в фосфатно-солевой буфере с 0,1% содержанием твина-20),

- раствор для промывки иммуносорбента (например, фосфатно-солевой буфер с содержанием 0,1% твина-20),

- положительный контрольный образец (К+) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от больных ИКБ, содержащий антитела классов G и М,

- отрицательный контрольный образец (К-) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от практически здоровых доноров, не содержащий антитела классов G и М к возбудителю ИКБ.

Предпочтительным вариантом выполнения изобретения является проведение одновременного анализа группы исследуемых образцов с использованием иммуносорбента, на котором размещено от 12 до 16 эрреев (идентичных зон) с иммобилизованными значимыми антигенами возбудителей боррелиоза, и вспомогательными контролями. Каждый эррей служит для постановки одного исследуемого или контрольного образца. При проведении анализа на один эррей вносят положительный контрольный образец тест-системы (К+) для исследования валидности тест-системы. Еще один эррей занимают отрицательным контрольным образцом тест-системы (К-). На оставшиеся незанятые эррей вносят исследуемые образцы.

В качестве твердой фазы для иммуночипов могут служить микроскопные слайды шириной 25±1 мм, длиной 75±1 мм и толщиной 1 мм с модифицированной поверхностью (могут содержать эпокси-, альдегидные, аминогруппы, полимеры и т.п.) или покрытые нитроцеллюлозой. Для исключения слияния образцов эррей разделяют специальными устройствами - рамками-герметиками. Существуют коммерчески доступные рамки и держатели слайдов, например, фирмы «Whatman», США, разделяющие эррей при проведении анализа.

Технология печати позволяет нанести биологические вещества также на дно лунки полистиролового планшета для ИФА, что делает возможным использование планшета в качестве иммуносорбента, причем одна лунка планшета соответствует одному эррею и предназначена для анализа одного образца.

С помощью современных установок печати - плоттеров - диагностически значимые антигены боррелий, вспомогательные контроли иммобилизуют (сорбируют) на поверхность твердой фазы в виде индивидуальных точек или слотов размером от 50 до 500 микрон. Для исключения ошибок при печати (пропуск печати) или в процессе проведения анализа на иммуночипе каждый антиген, вспомогательные контроли иммобилизуют раздельно по меньшей мере, в двух повторах. При анализе результатов тестирования образцов в расчет принимают среднее по слотам значение сигнала флуоресценции. Вспомогательными контролями являются:

- внутренний отрицательный контроль (сорбционный буфер) служит для контроля качества печати;

- иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека служат для контроля внесения раствора коньюгата в эррей;

- антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека служат для контроля внесения образца в эррей;

- маркеры границ эрреев, которые иммобилизуют по границам каждого эррея, позволяют после проведения анализа визуально наблюдать расположение эрреев и контролировать наложение «сетки» при использовании оператором программы обсчета результатов.

В качестве маркеров границ эрреев чаще всего иммобилизуют любой неспецифический для диагностики боррелиоза белок, например, БСА, модифицированный одним из флуорофоров.

Краткое описание фигур

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:

На Фигуре 1 показан вариант исполнения иммуносорбента диагностической тест-системы для серологической дифференциальной диагностики иксодового клещевого боррелиоза в виде слайда, содержащий 12 эрреев.

На Фигуре 2 показан увеличенный в масштабе эррей.

Иммуносорбент представляет собой слайд 1 (Фиг.1) в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью, который разделен на эррей 2, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга. Границы 3 эрреев 2 для предотвращения слияния образцов обеспечивают наложением специальной рамки (рамка на чертеже не показана). Эррей 2 (Фиг.2) содержат споты 4 в виде индивидуальных точек.

На фигуре 3 показан пример флуоресцентного изображения профилей эрреев на разных каналах для пациента с положительным серологическим диагнозом «иксодовый клещевой боррелиоз» (3 стадия), сыворотка крови которого содержит антитела класса G к ИКБ и не содержит антитела класса М

Осуществление изобретения

На иммуносорбент раздельно иммобилизуют диагностически значимые антигены/синтетические пептиды, относящихся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato - возбудителя боррелиоза. В частности, к ним могут быть отнесены известные антигены: Borrelia garinii p 100, Borrelia afzelii p 100, Borrelia garinii p41, Borrelia afzelii p41, Borrelia garinii BBK32, Borrelia afzelii BBK32, Borrelia garinii p17, Borrelia afzelii p 17, Borrelia garinii OspC, Borrelia afzelii OspC, Borrelia afzelii p39, Borrelia afzelii p58, Borrelia afzelii VlsE, Borrelia garinii VlsE. Приведенный перечень антигенов не является ограничивающим и специалисту в данной области известны и другие диагностически значимые антигены/синтетические пептиды.

Например, на территории РФ наиболее часто встречается зараженность клещей Borrelia afzelii и Borrelia garinii, и в этом случае целесообразно включать в состав иммуносорбента значимые антигены данных геновидов. С целью минимизации эффекта перекрывания иммуногенных эпитопов антигенов и повышения чувствительности иммуночипа наиболее оправдано размещать вышеуказанные антигенные группы индивидуально. По нашим наблюдениям, иммунореактивность белков разных геновидов в случае моноинфекции (инфицированности пациента только одним геновидом) отличается и, как правило, превалирует уровень антител к данному геновиду.

Ниже приведена клиническая/диагностическая значимость основных антигенов боррелий по данным специалистов, занятых в области изучения иммунопатогенеза ИКБ.

p100 - белок мембранных везикул, иммуногенен, при хронической стадии к нему обнаруживают преимущественно IgG, высокоспецифичен. Является типичным маркером поздней или хронической фазы заболевания. В некоторых случаях в острой стадии болезни Лайма определяются IgM антитела данного против антигена. В данной ситуации можно предположить о большой вероятности перехода болезни Лайма в хроническое течение.

VlsE-экспонированный на поверхности липопротеин (Variable major protein-like sequence), высокоспецифический домен IR6 часто используют в ИФА.

p58 - мембранный белок, иммуногенен.

Антиген p41int - иммуногенен, внутренний специфический участок флагеллина. В ранней стадии болезни Лайма во многих случаях отмечается наличие только IgM антител против антигена p41 и высокоспецифичного антигена OspC, что позволяет диагностировать раннюю стадию болезни Лайма.

р39=ВmрА - основной белок мембраны, закодирован в хромосоме, слабо иммуногенен, но высокоспецифичен, часто используется для производства ИФА тестов в Европе.

BbK32 - фибронектинсвязывающий белок, локализован в наружной мембране, иммуногенен, специфичен, определяется на всех стадия заболевания.

OspC- липопротеин внешней мембраны боррелии, маркер ранней фазы.

p17=DbpA (Decorin-binding protein A) - чувствительный и специфичный антиген. Дополнительно в пределах каждого эррея иммобилизуют вспомогательные контроли.

С целью определения антител различных классов на одном иммуносорбенте в соответствие с настоящим изобретением предложено использовать конъюгат, представляющий собой смесь антивидовых антител к IgG человека и к IgM человека, которые модифицированы соответственно различными по спектральным характеристикам флуорофорами. Антитела к IgG человека модифицированы, например, флуорофором Су5, а антитела к IgM человека модифицированы, например, флуорофором Су3. В процессе сканирования при активации соответствующих каналов флуоресцентного сканера становится возможным дифференцирование антител разных классов. Для этого в программе сканера указывается вид используемых в конъюгате флуорофоров или соответствующие им параметры длин волн возбуждения и эмиссии, и сканер автоматически активирует указанные каналы.

В качестве флуоресцентных красителей могут быть использованы любые флуорофоры активные в диапазоне видимого света, например, SybrGreenI, FAM, TET, JOE, VIC, HEX, ROX, TAMRA, Су3, Cy3.5, Су5, Cy5.5, OregonGreen^ТМ, CALRed^ТМ, Red 640, TexasRed.

Способ серологической диагностики боррелиоза с помощью диагностической тест-системы в виде иммуночипа осуществляется следующим образом.

На иммуносорбент с предварительно иммобилизованными раздельно значимыми антигенами, относящиеся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato, вносят раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, после этого вносят контрольные и исследуемые образцы (предпочтительное конечное разведение вносимых образцов к раствору для разведения -1:10). После этого проводят инкубирование полученной смеси при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин (предпочтительно с использованием термошейкера с вращением платформы 500 оборотов в мин) для образования комплекса антиген-антитело. Далее иммуносорбент, с целью удаления непрореагировавших компонентов, промывают не менее одного-двух раз раствором для промывки иммуносорбента, например, 1-кратным фосфатно-солевым буфером (рН - 7.2) с добавлением 0.1% твина-20.

На иммуносорбент вносят раствор конъюгата из смеси анти-IgG и анти-IgM человека, модифицированные различными по спектральным характеристикам флуорофорами, предварительно подготовленный из конъюгата и раствора для разведения конъюгата. Проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин. Для обеспечения наилучшего результата инкубирование проводят с использованием термошейкера с вращением платформы 500 оборотов в мин. После этого иммуносорбент промывают рабочим раствором для промывки иммуносорбента и высушивают для последующей детекции результатов анализа.

На иммуносорбент дополнительно могут быть раздельно иммобилизованы, по крайней мере, один антиген и/или пептид, выбранный, например, из группы Borrelia garinii p 100, Borrelia afzelii p 100, Borrelia garinii p41, Borrelia afzelii p41, Borrelia garinii BBK32, Borrelia afzelii BBK32, Borrelia garinii p17, Borrelia afzelii p17, Borrelia garinii OspC, Borrelia afzelii OspC, Borrelia afzelii p39, Borrelia afzelii p58, Borrelia afzelii VlsE, Borrelia garinii VlsE, а также вспомогательные контроли (антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека и/или иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека и/или внутренний отрицательный контроль и/или маркеры границ эрреев).

Детекцию образовавшегося комплекса антиген-антитело проводят с помощью многоканального флуоресцентного сканера для биочипов при активации соответствующих каналов. Обработку результатов сканирования проводят согласно инструкции к используемому программному обеспечению, прилагаемого к сканеру. Выявление антител проводят, исходя из оценки интенсивности сигналов флуоресценции в местах локализации специфических антигенов/пептидов на иммуносорбенте.

Далее рассчитывают значение критического уровня коэффициента флуоресценции (cut off) для каждого из иммобилизованных антигенов. Значение критического уровня коэффициента флуоресценции для каждого антигена вычисляют, например, путем умножения коэффициента флуоресценции в эррее с внесенным отрицательным контрольным образцом (К-) на значение альфа, которое устанавливается предприятием-изготовителем биочипа для каждой серии чипов путем статистического анализа. Рассчитывают коэффициенты позитивности для каждого исследуемого образца для всех иммобилизованных антигенов. Коэффициент позитивности представляет собой отношение коэффициентов флуоресценции к критическому уровню коэффициента флуоресценции (cut off). По значению коэффициентов позитивности делаются выводы о наличии или отсутствии антител к иммобилизованным антигенам.

Результаты проведения анализа на чипе считают валидными (достоверными), если соблюдаются следующие условия:

- на одном специфическом канале, например Су5 (определение антител класса G) в пределах каждого эррея должны флуоресцировать споты, соответствующие иммобилизованному иммуноглобулину IgG человека. Сигнал флуоресценции данных спотов должен быть выше уровня флуоресценции фона на эррее не менее чем в три раза,

- на втором специфическом канале, например Су3 (определение антител класса М) в пределах каждого эррея должны флуоресцировать споты, соответствующие иммобилизованному иммуноглобулину IgM человека. Сигнал флуоресценции данных спотов должен быть выше уровня флуоресценции фона на эррее не менее чем в три раза,

- уровень флуоресценции спотов, соответствующие локализации внутреннего отрицательного контроля (сорбционный буфер) не должен превышать уровень флуоресценции фона эррея более чем в три раза,

- уровень флуоресценции всех спотов, соответствующие локализации антигенов на специфических каналах Су5 и Су3 в эррее с внесенным отрицательным контрольным образцом (К-) тест-системы не должен превышать уровень флуоресценции фона на эррее более чем в три раза.

Далее проводят дифференциальную диагностику антител к ИКБ в соответствии с инструкцией по применению к тест-системе. Критерии интепретации в иммуночипе на наличие/отсутствие антител к иммуноглобулинам класса G (IgG) и класса М (IgM) см. таблицы 1 и 2.

Таблица 1
Критерии интерперетации в иммуночипе на наличие/отсутствие антител к иммуноглобулинам класса G (IgG) на канале Су5.
отрицательный результат	1. для всех антигенов Вorrelia afzelii и Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности меньше 1,1.
	2. для антигенов р17 Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1
положительный результат	Наличие одного из нижеуказанных спектров специфических антител:

	1. для всех антигенов Borrelia afzelii и Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1;
	2. для антигенов VlsE Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности больше 1,1 (в сочетании или без антител к другим значимым антигенам боррелий с коэффициентами позитивности больше или равные 1,1);
	3. выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1 как минимум для двух антигенов Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii из группы: p100, p41, р17, OspC, p58, Bbk32, p39.
неопределенный результат	выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1 для одного антигена Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii из группы: p100, p41, OspC, p58, Bbk32, p39.
Примечание:	При наличии неопределенного результата или с целью динамического наблюдения за развитием болезни, результатами лечения болезни Лайма рекомендуется повторное тестирование в иммуночипе нового образца сыворотки/плазмы крови человека через 1-3 месяца одновременно с постановкой образца, взятого ранее и хранившегося в условиях заморозки (допускается оттаивание-замораживание не более двух раз).

Таблица 2.
Критерии интерперетации в иммуночипе на наличие/отсутствие антител к иммуноглобулинам класса М (IgM) на канале Су3.
отрицательный результат	для всех антигенов Borrelia afzelii и Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности меньше 1,1.
положительный результат	Наличие одного из нижеуказанных спектров специфических антител:
	1. для всех антигенов Borrelia afzelii и Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1;
	2. для антигенов OspC Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii выявлены значения коэффициентов позитивности больше 1,1 (в сочетании или без антител к другим значимым антигенам боррелий с коэффициентами позитивности больше или равные 1,1);
	3.выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1 как минимум для двух антигенов Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii из группы: р41, р17, VlsE.
неопределенный результат	выявлены значения коэффициентов позитивности больше или равные 1,1 только для одного антигена Borrelia afzelii и/или Borrelia garinii из группы: р100, р41, р17, р58, Bbk32,p39.
Примечание	При подозрении острой стадии инфекции рекомендовано повторное тестирование в иммуночипе образца сыворотки/плазмы крови человека, взятого через 10-14 дней

после первичного скринига. При остром боррелиозе антитела класса М, как правило, персистируют до 3 месяцев (однако, у ряда пациентов отмечена персистенция антител класса М годами). Рекомендуется тестирование в иммуночипе нового образца сыворотки/плазмы крови человека с одновременной постановкой образца, взятого ранее и хранившегося в условиях заморозки (допускается оттаивание-замораживание не более двух раз).

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1.

Дифференциальная серологическая диагностика иксодового клещевого боррелиоза на примере анализа сыворотки крови пациента А-ва А.И.

Больной А-в А.И - ИКБ, 3 стадия, хронический Лайм-артрит, наблюдается в Институте ревматологии РАМН с 2003 года.

Серологическую диагностику проводят с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа.

Пример выполнения серологической дифференциальной диагностики ИКБ приведен для одного пациента.

На иммуносорбент в виде слайда раздельно иммобилизуют в виде спотов антигены Borrelia garinii p 100, Borrelia afzelii p 100, Borrelia garinii p41, Borrelia afzelii p41, Borrelia garinii BBK32, Borrelia afzelii BBK32, Borrelia garinii p17, Borrelia afzelii p17, Borrelia garinii OspC, Borrelia afzelii OspC, Borrelia afzelii p39, Borrelia afzelii p58, a Borrelia afzelii VlsE и VlsE Borrelia garinii, вспомогательные контроли (в конкретном примере: смесь антивидовых антител к иммуноглобулинам IgG человека и антивидовых антител к иммуноглобулинам IgM человека, смесь иммуноглобулинов IgG и IgM человека, внутренний отрицательный контроль (сорбционный буфер), маркеры границ эрреев). Схема расположения иммобилизованных спотов на эррее приведена в примере исполнения эррея 2.

Вставляют в рамку-держатель для слайдов фирмы Whatman слайд. Сверху на слайд (на стороне маркировки) надевают рамку-трафарет фирмы Whatman для предотвращения контаминации (слияния) образцов. Промывают иммуносорбент один раз рабочим раствором для промывки, внося в каждый эррей (лунку) по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. После инкубации содержимое из лунок рамок-трафарета аккуратно убирают, не повреждая центральное поле лунки, соответствующее расположению эррея на слайде. Не снимая трафарет, высушивают поверхность иммуносорбента. Далее в эррей иммуносорбента вносят 90 мкл раствора для разведения образцов. В один из эрреев иммуносорбента вносят 10 мкл К+, в другой вносят 10 мкл К-, в незанятый эррей вносят по 10 мкл исследуемой сыворотки/плазмы крови. При изучении на наличие антител в спинномозговой жидкости пациента исследуемый материал (спинномозговую жидкость/ликвор) вносят без предварительного разведения, т.е. 100 мкл. Иммуносорбент закрывают крышкой и инкубируют 30 мин на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С. Промывают иммуносорбент рабочим раствором для промывки, внося в каждый эррей по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. После этого вносят по 100 мкл рабочего раствора для отмывки в каждый эррей иммуносорбента и инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. Затем в каждый эррей иммуносорбента вносят по 60 мкл рабочего раствора конъюгата, закрывают иммуносорбент крышкой и инкубируют 30 мин на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С. Промывают иммуносорбент один раз рабочим раствором для промывки, внося в каждый эррей по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. Снимают с иммуносорбента рамку-трафарет, иммуносорбент ополаскивают дистиллированной водой. Высушивают слайд. После проведения анализа слайд сканируют на многоканальном сканере для биочипов, активируя каналы Су 5 и Су3.

Проводят учет результатов согласно инструкции по применению к диагностической тест-системы в формате иммуночипа. Рассчитывают коэффициенты позитивности (КП) для всех иммобилизованных антигенов. При КП>1,1 иммунореактивность по определенному антигену считается положительной.

На Фиг.3А показан флуоресцентный профиль эррея, демонстрирующий наличие в сыворотке крови пациента специфических антител класса G (IgG) к антигенам р100 Borrelia garinii и Borrelia afzelii, p58 Borrelia afzelii, p41 Borrelia afzelii, p39 Borrelia afzelii, Bbk32 Borrelia afzelii, p 17 Borrelia afzelii на канале Су 5.

На Фиг.3Б продемонстрирован профиль того же эррея, свидетельствующий об отсутствии антител класса М к антигенам (на канале Су3).

В результате расчета были получены следующие коэффициенты позитивности (КП).

По каналу Су 5 (наличие IgG):

КП (p100 Borrelia garinii) - 2.2

КП (p100 Borrelia afzelii) - 7.3

КП (VlsE Borrelia garinii и Borrelia afzelii) - 0,8

КП (p58 Borrelia afzelii)- 32,4

КП (p41 Borrelia garinii) - 0,6

КП (p41 Borrelia afzelii) - 5,5

КП (p39 Borrelia afzelii) - 2,1

КП (Bbk32 Borrelia garinii) - 0,7

КП (Bbk32 Borrelia afzelii) - 48,9

КП (OspC Borrelia garinii) - 0,4

КП (OspC Borrelia afzelii) - 0,6

КП (p17 Borrelia garinii) - 0,5

КП (p17 Borrelia afzelii) - 51,1

По каналу Су3 (наличие IgM):

КП (p100 Borrelia garinii) - 0,8

КП (p100 Borrelia afzelii) - 0,4

КП (VlsE Borrelia garinii и Borrelia afzelii) - 0,3

КП (p58 Borrelia afzelii)- 0,7

КП (p41 Borrelia garinii) - 0,6

КП (p41 Borrelia afzelii) - 0,6

КП (p39 Borrelia afzelii) - 0,4

КП (Bbk32 Borrelia garinii) - 0,6

КП (Bbk32 Borrelia afzelii) - 0,3

КП (OspC Borrelia garinii) - 0,4

КП (OspC Borrelia afzelii) - 0,5

КП (p17 Borrelia garinii) - 0,4

КП (р17 Borrelia afzelii) - 0,71

Согласно интерпретации результатов в иммуночипе, выявлены в сыворотке крови пациента специфические антитела класса G, что подтверждает давнюю инфицированность пациента ИКБ.

Пример 2.

Оценка чувствительности, специфичности тест-системы в формате иммуночипа для серологической диагностики ЛБ.

Материал и методы.

1. Иммуночип для серологической диагностики ЛБ.

Была изготовлена экспериментальная серия тест-системы для выявления спектра антител классов G и М к антигенам Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Дизайн одного эррея иммуносорбента представлен в примере исполнения эррея 1.

Использование одного иммуносорбента (слайда с иммобилизованными рекомбинантными антигенами) позволяет провести серологический диагноз для 12 образцов клинического материала, включая контрольные сыворотки. Анализ на чипе проводили согласно Инструкции по применению (последовательность постановки и правила интерпретации результатов описаны в примере 1).

2. Клинический материал.

Для оценки чувствительности в работе были исследованы образцы сывороток/плазмы крови от 79 пациентов, взятых в срок до 1 месяца с момента присасывания клеща. У данных больных в большинстве случаев наблюдалась характерная клиническая картина, свойственная начальной стадии клещевого боррелиоза (у 56 пациентов выявлена мигрирующая эритема, почти все больные отмечали лихорадку). Совокупность клинических и лабораторных данных позволило отнести данный клинический материал к 1 стадии заболевания. Также изучены образцы сывороток/плазмы крови от 150 пациентов с диссеминированной и хронической стадиями ИКБ.

Для оценки специфичности тест-системы в формате иммуночипа была сформирована контрольная группа, включающая 495 сывороток/плазмы крови от лиц, не имеющих специфические антитела к боррелиям, среди которых 250 образцов получены от практически здоровых доноров, никогда не отмечавших ранее присасывание клещей; 50 - от беременных и больных с аутоиммунными заболеваниями; от пациентов, страдающих спирохетозами иной этиологии, отличной от боррелиоза, в частности, 130 образцов получены от больных сифилисом; 65 образцов - от больных лептоспирозом.

Клинический материал был предоставлен НИИ ревматологии РАМН (г.Москва), МОНИКИ им.Владимирского (г.Москва), а также центрами Госсанэпиднадзора г.Москвы, г.С.-Петербурга, г.Кирова, г.Ижевска, г.Екатеринбурга, г.Ярославля и рядом других клинических баз.

Полученные результаты и обсуждение.

Анализ полученных данных при изучении образцов от больных ИКБ показал, что выявление специфических антител классов М (IgM) среди пациентов, отнесенных к 1-ой клинической стадии боррелиоза, достигал 60,1%, а антител класса G - 31,6%. Выявление IgGH/или IgM позволило подтвердить серологический диагноз боррелиоза для 87, 3% пациентов в этой группе. Выявление IgM в группе пациентов 2 и 3 стадией ЛБ достигало 51,4%, а антител класса G (IgG) - у 88,6%. Суммарное выявление антител в чипе достигало 98,1%.

Следует отметить, что процент выявления суммарных специфических иммуноглобулинов обоих классов у пациентов на ранней стадии заболевания с помощью иммуночипа является наиболее высоким среди всех зарегистрированных в РФ тест-систем подобного назначения, работающих в формате ИФА и иммунного блота. Так, по результатам Государственных сравнительных испытаний, проводимых в ГИСК им. Л.А.Тарасевича в 2003-2004 годах, процент суммарного выявления специфических антител в группе больных, отнесенных к 1 стадии ЛБ, в ИФА-тест-системах не превышал 77,2% (параллельное тестирование в тест-системах производства ООО«Омникс» «Боррелиоз-ИФА-IgG» и «Боррелиоз-ИФА-IgM»), а при анализе выборки клинических образцов от больных ИКБ (2, 3 стадии) наиболее высокую чувствительность - 91,3% -продемонстрировала тест-система «Enzygnost Borreliosis-IgG+IgM» производства «Dade Behring Marburg GmbH» (Манзенюк И.Н., Манзенюк О.Ю. в книге «Клещевые боррелиозы», 2004 г.)

Анализ сывороток крови человека вышеописанной контрольной группы показал отсутствие специфических IgM и IgG при постановке в иммуночипе в 97,2%.

Полученные нами данные свидетельствуют о высоких показателях чувствительности, специфичности иммуночипа.

Количество сомнительных результатов при изучении опытной группы составило 9,2% - при исследовании спектра на наличие специфических анти-IgM и около 12% для спектра по анти-IgG. Процент выявления неопределенных результатов в чипе при анализе контрольной группы был несколько ниже: по антителам класса М - 5,3%, для IgG - 4%.

Представлял интерес изучить частоту встречаемости антител к определенному антигену среди группы больных с острой формой ИКБ (1 стадия) и пациентов с диссеминированной и хронической формами боррелиоза (2 и 3 стадии). Полученные данные продемонстрированы в таб. 3. Совокупность клинических проявлений ЛБ и анализ паттерна антител при исследовании пациентов острой и хронической стадиями позволяет сделать вывод, что при обострении заболевания или в начальной стадии инфицированности антитела к OspC, как правило, доминируют. Высокие уровни антител отмечаются также к р17, р41. Вместе с тем, в периоды обострения инфекции или в острой начальной стадии антитела к другим антигенам встречаются значительно реже, в особенности к p100, VlsE, Bbk32.

Исследование на иммуночипе клинических образцов является информативным тестом для специалистов, занятых в области изучения иммунопатогенеза ИКБ, т.к. позволяет одновременно оценить широкий спектр антител к диагностически/клинически значимым антигенам боррелий обоих классов.

Пример 3.

Сравнительная оценка чувствительности иммуночипа и тест-систем подобного назначения.

Материал и методы.

1. Иммуночип для серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза. Была изготовлена экспериментальная серия тест-системы для выявления спектра антител классов Gи М к антигенам Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Дизайн одного эррея иммуносорбента см. пример исполнения эррея 1. Анализ на чипе проводили согласно инструкции по применению (последовательность постановки и правила интепретации результатов описаны в примере 1).

2. Тест-системы сравнения:

- иммуноферментная тест-система «Боррелиоз-ИФА-IgM» (ООО «Омникс», Санкт-Петербург),

- иммуноферментная тест-система «Боррелиоз-ИФА-IgG» (ООО «Омникс», Санкт-Петербург),

- тест-система в формате иммуноблота «recomBlot Воrrlia_NB IgM, IgG», производства «Mikrogen», Германия,

- тест-система «Borrelia LIAISON Serology Line» (DiaSorin, Италия) на хемилюминесцентном анализаторе LIAISON.

3. Клинический материал.

В работе были исследованы образцы сывороток/плазмы крови от 19 пациентов, взятых в срок до 1 месяца с момента присасывания клеща (см. табл.4, 1-19). Совокупность клинических и лабораторных данных позволило отнести данный клинический материал к 1 стадии заболевания. Также изучены образцы сывороток/плазмы крови от 22 пациентов с диссеминированной и хронической стадиями ИКБ (см. табл.4, 20-41). Клинический материал был предоставлен НИИ ревматологии РАМН (г.Москва), МОНИКИ им.Владимирского (г.Москва), а также рядом центров Госсанэпиднадзора.

Полученные результаты и обсуждение.

Данные тестирования представлены в табл.4.

Таблица 4.
Результаты тестирования на наличие антител классов G и М к боррелиям в чипе
	Сыворотки	IgM			IgG
		Омникс	DiaSorin	чип	Омникс	DiaSorin	чип
1	1350-2	+	+	+	-	-	+
2	1022-3	-	-	сомн.	-	-	+

3	855-2	+	+	сомн.	-	-	сомн
4	1194-1	-	+	сомн.	-	-	-
5	947-2	-	-	+	+	+	+
6	954-4	-	-	сомн.	-	сомн	+
7	1277-2	-	-	сомн.	-	+	+
8	989-3	-	-	+	-	-	-
9	902-2	-	-	+	-	-	сомн
10	1042-3	-	-	-	-	-	+
11	1090-3	-	-	-	-	сомн	+
12	903-1	-	-	+	-	-	+
13	934-3	-	-	+	-	+	+
14	1158-1	-	-	-	+	сомн	+
15	842-3	-	-	+	-	-	сомн
16	945-2	-	-	+	-	-	+
17	931-2	-	-	-	+	сомн	+
18	907-2	-	сомн.	+	-	-	-
19	1319-2	-	-	+	-	сомн	сомн
20	1	-	-	+	+	+	+
21	2	+	+	+	-	+	+
22	3	+	+	+	+	+	+
23	4	-	-	-	-	сомн	+
24	5	-	-	сомн	-	+	+
25	6	+	+	+	-	+	+
26	7	-	+	+	+	+	+
27	8	+	+	+	+	+	+
28	9	+	+	+	+	+	+
29	10	-	-	+	+	+	+
30	11	+	+	+	-	-	-
31	12	-	+	+	-	-	-
32	13	+	сомн	+	-	-	+
33	14	-	-	+	+	+	+
34	15	-	-	-	сомн		+
35	16	сомн	+	+	+	+	+
36	17	-	-	-	-	-	+
37	18	-	+	+	-	сомн	+
38	19	-	+	-	+	+	+
39	20	-	-	-	+	+	+
40	21	сомн	сомн	+	-	сомн	+
41	22	-	-	-	+	-	-
Примечание: в соответствии с инструкцией по применению и правилами интерпретации результатов конкретной тест-системы положительный результат обозначен как +, отрицательный результат как - ,сомнительный результат - сомн.

Исходя из полученных нами данных, чувствительность тест-системы в формате иммуночипа превосходит тест-системы сравнения, что наиболее выражено при изучении клинического материала от пациентов с 1-ой стадией ИКБ. Дополнительное изучение дискордантных образцов, давших положительный результат при исследовании с помощью иммуночипа и отрицательный в тест-системах производства ООО «Омникс» и фирмы «DiaSorin», было проведено методом иммунного блоттинга с использованием «recomBlot Воrrelia_NB IgM/IgG» производства «Mikrogen», Германия. Было установлено, что из 13 образцов, содержащих антитела класса IgM, которые выявлены с помощью иммуночипа, 5 сывороток, согласно результатам в иммуноблоте содержали анти-IgM и 3 результата были неопределенными. Следует отметить, что 4 образца расценивались как отрицательные, несмотря на наличие антител класса IgM к одному антигену VlsE или р41, т.к. по правилам интерпретации к тест-системе «recomBlot Borrelia_NB IgM/IgG» количество баллов было ниже пяти, что не позволило считать эти результаты как положительные или даже сомнительные.

Из восьми образцов, содержащих антитела класса G, выявленные в результате анализа в иммуночипе, три сыворотки, согласно результатам в иммуноблоте содержали анти-IgG и два результата были неопределенными.

Пример исполнения эррея 1

р100	р100	VlsE	VlsE	р58	р41	р41	маркер
B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii
р100	р100	VIsE	VIsE	р58	р41	р41	маркер
B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii
p39	ВВК32	ВВК32	OspC	OspC	р17	р17	маркер
B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii
p39	ВВК32	ВВК32	OspC	OspC	р17	р17	маркер
B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii	B.garinii	B.afzelii
IgG человека, концентра ция 1	IgG человека, концентра ция 2	IgG человека, концентра ция 3	IgG человека, концентра ция 4	IgG человека концентра ция 5	IgG человека концентра ция 6	сорбционный буфер	маркер
IgG человека, концентрация 1	IgG человека, концентрация 2	IgG человека, концентрация 3	IgG человека, концентрация 4	IgG человека концентрация 5	IgG человека концентрация 6	сорбционный буфер	маркер
IgM человека, концентрация 1	IgM человека, концентрация 2	IgM человека, концентрация 3	IgM человека, концентрация4	IgM человека концентрация 5	IgM человека концентрация 6	сорбционный буфер	маркер
IgM человека, концентрация 1	IgM человека, концентрация 2	IgM человека, концентрация 3	IgM человека, концентрация4	IgM человека концентрация 5	IgM человека концентрация 6	сорбционный буфер	маркер
маркер	маркер	маркер	маркер	маркер	маркер	маркер	маркер

Пример исполнения эррея 2

Таким образом, предлагаемая диагностическая тест-система в виде иммуночипа позволяет повысить эффективность проведения серологического анализа ИКБ, т.к. предложенная в соответствии с настоящим изобретением система может определять широкий спектр антител в сыворотке/плазме крови человека и/или спинномозговой/синовинальной жидкости и одновременно дифференцирует их по классам G и М на одном иммуносорбенте.

Предлагаемый способ серологической дифференциальной диагностики с помощью диагностической тест-системы в формате иммуночипа - высокочувствителен и специфичен, прост в выполнении, исключает субъективность оценки, благодаря автоматизированной интерпретации результатов. При проведении анализа с использованием предлагаемой диагностической тест-системы в формате иммуночипа требуется минимальный объем исследуемого материала.

1. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза, включающая

иммуносорбент в виде слайда, разделенного на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца, или в виде иммунологического планшета, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца, с иммобилизованными в пределах границы каждого эррея или лунки планшета слотами, содержащими диагностически значимые антигены/синтетические пептиды, относящихся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato, а также вспомогательные контрольные споты для проведения стандартизации анализа на иммуночипе и проверки валидности тест-системы,

конъюгат, состоящий из смеси вторичных антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных двумя различными по спектральным характеристикам флуорофоровыми красителями.

2. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза по п.1, дополнительно содержащая реагенты, необходимые для проведения и валидации анализа.

3. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза по п.1, где каждый эррей слайда или лунка планшета содержит комбинацию раздельно иммобилизованных слотов, каждый из которых содержит по меньшей мере один диагностически значимый рекомбинантный антиген/синтетический пептид, выбранный из группы: Borrelia garinii p 100, Borrelia afzelii p100, Borrelia garinii p41, Borrelia afzelii p41, Borrelia garinii BBK32, Borrelia afzelii BBK32, Borrelia garinii p17, Borrelia afzelii p17, Borrelia garinii OspC, Borrelia afzelii OspC, Borrelia afzelii p39, Borrelia afzelii p58, Borrelia afzelii VlsE, Borrelia garinii VlsE.

4. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза по п.1, где вспомогательные контрольные споты в пределах каждого эррея слайда или лунки планшета для стандартизации анализа на иммуночипе могут быть представлены по меньшей мере одним из нижеперечисленных вариантов:

- рядом спотов, содержащих одинаковую концентрацию любого незначимого для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза белка/пептида, модифицированного флуорофоровыми красителями, аналогичными тем, что используются в конъюгате тест-системы,

- рядом спотов, содержащих различные концентрации иммуноглобулина IgG человека,

- рядом спотов, содержащих различные концентрации иммуноглобулина IgM человека,

- рядом спотов, содержащих различные концентрации антител к IgG человека,

- рядом спотов, содержащих различные концентрации антител к IgM человека,

- отрицательным контролем в пределах каждого эррея - сорбционный буфер, не содержит антиген или иной белок.

5. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза по п.1, где иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной химически поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

6. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической диагностики иксодового клещевого боррелиоза по п.2, где в качестве реагентов, необходимых для проведения и валидации анализа, диагностическая тест-система содержит раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, раствор для разведения конъюгата, раствор для промывки иммуносорбента, положительный контрольный образец (К+), отрицательный контрольный образец (К-).