Способ оценки стресс-устойчивости животных

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ Ю Ф

<п>782781

Союз Советскик

Социалистических

Республик

М АВТОРСКОМУ СВИДИТИЗЬСУВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 20.03.79 (21) 2737985/30-15 (51)М. Кл.

A 01 К 67/00 II

A 61 В 5/16//

G 01 и 33/50 с присоединением заявки Ho— (23) Приоритет—

Государственный комитет

СССР по делам нзобретеннй н открытий

Опубликовано 3911ЯО. Бюллетень Йо 44 (53) УА1 577. 156. 6 (088. 8) Дата опубликования описания 301180

I (72) Авторы изобретения

В.И.Шепотиновский и З.И.Иикашннович

Ростовский государственный медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТРЕСС-УСТОЙЧИВОСТИ

ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медици- ны, конкретно к методам отбора животных для эксперимента, и может быть использовано для выявления устойчивых животных к действию шокогенной травмы.

Известен способ оценки стрессустойчивости животных по реакции напряжения задней части тела в ответ на галатановый наркоз.

Однако данный способ не позволяет выявлять животных, устойчивых к действию шокогенной травмы. б

Наиболее близким к изобретению по 15 технической сущности является способ определения функциональных воэможностей организма по уровню ферментной активности сыворотки крови животных, заключающийся в том, что определяют 26 активность в крови креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфотазы, аспартатаминотрасфенаэы и

О -глутамнлтрансферазы и по изменению уровня активности ферментов по сравнению с нормой оценивают функциональные возможности организма.

Однако данный способ также не обеспечивает отбора животных, устойчивых к шокогенной травме. 30

Целью изобретения является разработка способа выявления животных, устойчивых к действию шокогенной травмы.

Цель достигается способом, заключающимся в том, что у животного при

его иммобилизации исследуют в лейкоцитах и эритроцитах периферической крови комплекс субстратов и ферментов обмена глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы и показателей окислительно-восстановительных процессовг содержание лактата, акг тивности цитохромокскдазы, и по увеличению показателей активности указанных ферментов и содержания субстрата в лейкоцитах соответственно на

50-55%, 60-65% и 60-70В, 70-100%, в эритроцитах соответственно на 70-80%, 60-100% и 40-50%, 180-300% по сравнению с исходным уровнем судят об устойчивости животных к шокогенной травме, Способ осуществляют следующим образом.

Отобранное для опыта животное, например собака (беспородная), осматривается ветеринаром с целью выбраковывания животных с наличием патологии: устанавливается возраст, пол", = = вес. У собаки иэ бедренной вены эаби782781 4 окрашивают 0,4 мл диметилпарафенилендиамингидрохлорида (4 мг/мл), инкубация 10 мин при. 37оС. Результаты выра-. жают (В.C.Àñàòèàíè, 1969) в условных оптических единицах на 1 г (экстин.ция, полученная на СФ-4). установлено, что у устойчивых к шоку собак уровень активности ферментов утилизации глюкозы (глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы и гексокинаэы). и показателей окислительно-восстановительных процессов (уровень лактата

35 и активность цитохромоксидазы) после

5-минутного иммобилизационного стресса в лейкоцитах соответственно выше на 50-55%, 60-65% и 60-70%, 70-100%i в эритроцитах — на 70-80%, 60-100% и

40-50%,- 180-300% по сравнению с данными контроля.

Пример 1. Собака Чернушка, вес 16 кг. Проведен осмотр ветеринаром, Признаков явной паталогии не наблюдалось. Кровь забирадась до и после 5-минутного иммобилизационного стресса и в лейкоцитах и эритроцитах определялась активность глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, цитохромоксидазы и уровейь лактата.

Результаты определения сведены в табл.1.

Т а б л и ц а 1

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 10, 1 100 64,0

Гексокиназа

8,0 100 49,0 рается кровь в обычных спокойных усло-, виях — контроль. После этого собака фиксируется на столе с помощью намордника, прикрепленного к столу, и лямок, надетых на лапы в положении на спине — иммобилизационной стресс.

С момента полной фиксации начинаетсяотсчет времени. В первые 5 мин иммобилизационного стресса у животного путем пункции через кожу из задней вены голени забирается 10 мл -крбви в центрйфужные пробирки с 0,2 мл гепарина (5000 ме/мл). Для предотвращения образования сгустков крови содержимое пробирки осторожно перемешивается. Кровь центрифугируется при

1000 об/мин в течение 30 мин для получения плазмы. Плазма отсасйвается.

Для получения осадка лейкоцитов плаз ма центрифугируется при 1000 об/мин, в течение 12 мин и очищается физиоло— гическии раствором от примесей эритроцитов, Полученная плотная масса клеток гомогенизируется с 3,5 мл дистиллированной воды. В 0,1 мл гомогената определяется содержание белка.

Эритроциты промываются несколько раз равными объемами физиологического раствора и плотно центрифугируются при 3000 об/мин, 1-2 мм верхнего слоя отбрасывается. Приготавливается гемолизат с дистиллированной водой в соот-, ношении 1:20. В 0,02 мл гемолизата определяется гемоглобин. Расчет опре-( деляемых субстратов и ферментов, ведется на 1 r белка лейкоцитов и на 1 г гемоглобина. В приготовленные пробирки с субстратными смесями для опреде-ления ферментов разносится по 0,2 мл лизата лейкоцитов или гемолизата.

Для определения лактата отбирается соответственно 0,2 мл биологического материала и фиксируется 0,5 мл

20%-ной сернокислой медью, Лактат определяется в реакции с параоксидифенилом (1,5% раствором) по методу, описанному M.È.Ïðîõîðîâîé и З.Н.Тупи- ковой, Большой практикум по углеводному и лицидному обмену, Л., 1965.

Для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы отбирают

0,2 мл биологического материала.и помещают в инкубационную смесь, содержащую 0,2 мл НАДФ (1,5 Мг/1 мл), 0,2 мл сернокислого магния (120 мг в 1 мл) и 0,4 мл глюкозо-6-фосфата (22 мг/1 мл) и TPHC-буфер рН-8,5.

Инкубация 20 мин при 37 С. Ферментативная реакция прекращается добавлением 1 мл .1i2M раствора щелочи.

Для определения активности гексокиназы биологический материал 0,2 мл помещают в инкубационную смесь, содержащую 0,2 мл НАДФ (1,5 мг/мл), 0,2 мл сернокислого магния(120 мг/мл), 0,2 мл глюкозы (2,4 мг/мл) и 0,4 мл

АТФ (3,1 мг/мл), 1 мл ТРИС-буфера рН-7,5. Инкубация 10 мин при 37 С.

Ферментативную реакцию прекращают добавлением 1 мл 1,2 M раствора целочи. Эатем все пробы спектрофотометри15 руют на СФ-4 при 340 нм. Результаты выражают в мнкромолях НАДФ (мйн) 1 г.

Оценка способности клетки акцепти.ровать кислород ведется путем определения активности цитохромоксидазы: для этого 0,2 мл. биологического материала помещают в среду, содержащую

0,5 мп обратного буфера, рН 9,0, 0,2 мп цитохрома С (0 4 мг/мл) и, 100 15,7 55,4 108,9 70,2

100 12,7 58,7 104,5 113,2

782781.Продолжение табл.1

0,41 100 2,4 10

Лактат

Ф

Цитохромоксндаэа 3,20 100 1,84 100 6,40 100 7,60 313,0

A магистрального артериального давле

1ф ния стабилизировался (70-80 мм рт.ст.). Собака вышла из шокового состояния, Пример 2. Собака" Рыжик, вес.

16,5 кг. Проведен осмотр ветеринаром;

2р Признаков явной патологии не наблюда.! ется. Кровь забиралась до и после ;5-минутного иммобилизационного стрес-. са и в лейкоцитах и эритроцитах определялась активность глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназы, .гексокииазы, цитохро- . моксидазы и уровень лактата. Результаты определения сведены в табл.2.

Таблица 2.

Глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназа 11,7, 100 68,7 100

7,3,37,6 57,6 16. 7,7 100 56,0 100 4,0 48

0i37 100 2с83 100 0,18 51

Гексокиназа

46,9 17

1,3 54

Лактат

Цитохромоксидаэа 3,97 100 5 7 100 1,70 57 1,8 69 химических показателей в. зритроцитах и лейкоцитах, активности глюкоэо- 6-4осфатдегидрогеназы,гексокиназы,цитохромоксидазы и уровня лактата пос- ле 5-минутйого имаобилизационного стресса, производить отбор устойчивых особей к действию шокогенной травмы.

Понижение уровня исследуемых показателей в клетках крови, забранной "у ур собаки Рыжик после 5-минутного иммобилизационного стресса, свидетельствует о том, что исследуемое живот- . ное является неустойчивым к действию шокогенной травмы. Действительно, при нанесении стандартной травмы по Кеннону (200 ударов по внутренней поверхности верхней трети бедра у собаки

Рыжик после кратковременного подъема артериального давления (220 мм рт.от развился тяжелый травматический шок g) с выраженной шоковой гипотонией: (до 40-50 мм рт.ст.). Собака погибла череэ 90 мин после нанесения травмы

Таким образом, предлагаемый способ позволяет, оснбвываясь на уровне био- Я

ПовЫшение уровня исследуемых показателей в клетках крови после .5-минутного иммобилизационного стресса свидетельствует о том, что исследуемое животное является устойчивым к действию шокогенной травМы.

Действительно, при нанесении стандартной травма цо Кеннону (200 ударов по внутренней поверхности верхней трети бедра) у собаки Чернушки после подъема артериального давления до 230-240 мм рт.ст. регистрировалась кратковременная гипотония (50/55 мм рт.ст.), после чего уровень

Выявление исходного уровня резистентности организма к шокогенным воздействиям с помошью предлагаемого способа имеет важное значение с целью выработки рекомендаций для практического здравоохранения. Учет индивидуальных особенностей пострадавшего необходим для оценки реакции на травму и разработки методов противошоковой терапии.

782781

Формула изобретения

Составитель В.Романова

Редактор T. Пилипенко Техред А.щепанская Корректор М.Коста

Заказ 8407/3 Тираж 723 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðîä, ул.Проектная,4

Способ оценки стресс-устойчивости жиВотных путем-определения биохимических показателей крови до и после иммобилиэационного стресса, о т л и ч а ю ц и и с я тем, что, с целью выявления животных, устойчивых к шокогенной травме, в лейкоцитах и эритроцитах крови определяют активность глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, цитохромоксидаэы и уровень лактата и по увеличению этих показателей после иммобилизационного стрес са в лейкоцитах соответственно на

S 50-55%, 60-65%, 60-70%,70-100%; в эритроцитах - на 70-80%,60-100%, 40-50%, 180-300% по сравнению с исходным уровнем, животных считают стресс-устойчивыми.