Способ оценки микросомальной системы печени при действии ксенобиотиков алкилирующего типа
Использование: в медицине для оценки микросомальной системы печени при действии ксенобиотиков алкилирующего типа. Сущность изобретения: на кожу животного наносят ксенобиотик алкилирующего типа, затем забирают у животного пробу крови с последующим ее исследованием, при этом перед нанесением ксенобиотика животному вводят фармзонд - карбамазепин, к полученной плазме крови добавляют кислоту при постоянном перемешивании, затем добавляют хлороформ и избыточное количество сульфата аммония, отделяют осадок с последующим упариванием экстракта до сухого остатка при температуре 42 5oC, разделением остатка в условиях жидкостной обращенно-фазовой хроматографии с использованием в качестве элюэнта водно-метанолового раствора и ультрафиолетовым детектированием, и при увеличении содержания карбамазепина после воздействия ксенобиотика по сравнению с нормой оценивают активность микросомальных ферментов печени как нарушенную. Способ позволяет проводить оценку микросомальной системы печени при действии на организм малых доз кожно-нарывных отравляющих веществ, повысить качество исследований за счет определения параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные процессы организма. 5 табл.
Изобретение относится к области исследования или анализа материалов особыми способами, а именно к способам исследования крови при действии ксенобиотиков, и может быть использовано для оценки микросомальной системы печени после воздействия малых доз иприта и люизита при реальных путях поступления ОВ (отравляющих веществ) в организм, а также при решении задач по уничтожению ХО (химического оружия) в районах военно-химических объектов, в частности по обследованию здоровья населения и обслуживающего персонала в местах по хранению и уничтожению ХО.
К настоящему времени в практике исследования биоматериалов особыми способами для контроля тех или иных органов, систем органов существуют различные способы оценки состояния здоровья организма. Разработанные способы отличаются по аналитическому принципу, последовательности анализа и имеют различные биохимические параметры, характеризующие определенные процессы в организме. В настоящем описании приведены основные способы исследования, связанные с обоснованием комплекса показателей, отражающих степень повреждения организма. Ранее в экспериментальной практике проводили оценку состояния I и II фаз детоксикации ксенобиотиков после воздействия на организм токсичных соединений, например, таких как стирол, формальдегид, ацетон, фенол, СО, NO, SO2, Pb(NO3)2, NaNO3, FeSO4 с помощью определения цитохрома P450, цитохрома b5 печени, активности УДФ-глюкуронилтрансферазы и анализа скорости реакций N-деметилирования (амидопирина), гидроксилирования (анилина) (Muhambetova L.H. , Dolinskaya S.J., Nasonova A.A., Avaliani S.L. // Cytochrome P450 Biochem. and Biophys. : Proc. 7-th Int, Conf. Biotechnol. and Ecol. Aspects, Moscow, July 28-Aug, 2, 1991, Moscow, 1992, p. 580-582). Однако данный подход имеет ряд недостатков. Во-первых, для анализа содержания ферментов печени необходим гомогенат ткани печени, то есть эксперименты проводятся "in vitro". Кроме того, метод дает ограниченную информацию, характеризуя I и II фазы детоксикации ксенобиотиков, не затрагивая вопросы содержания вещества в плазме крови, способности организма к элиминации, распределения ксенобиотика по органам и тканям, а также времени задержки соединения в организме. Одним из информативных методов оценки функционирования метаболизирующих ферментных систем является фармакологическое зондирование. Но данный подход используется только в медицинской практике, в основном, для определения терапевтических доз лекарственных препаратов, в стационарных условиях лечения, при различной патологии печени (Бендиков Э.А., Логинов А.С., Петраков А.В. "Фармакокинетика и метаболизм антипирина у больных с хроническими поражениями печени". Методы индивидуализации и оптимизации применения лекарств на основе изучения их фармакокинетики. - М., 1982, ч. 2, с. 116-120). Что касается отравляющих веществ кожно-нарывного действия, то на протяжении многих десятилетий, в основном, оценивалась их токсичность, тогда как изучение воздействия малых (пороговых) доз этих ОВ на организм с позиций оценки вредного воздействия практически не изучалась. В медицинской практике также возможен прогноз развития хронического гепатита В при иммуноферментном анализе сыворотки крови, но в этом случае оценивается состояние организма при поражении вирусом, а не отравляющими веществами (G 01 N 33/535, А.Б. Жаляускас "Способ прогнозирования развития хронического гепатита В." Изобретения, 1992, N 28, с. 182). Возможность определения кожно-резорбтивного действия химических веществ описана в способе-прототипе (G 01 N 33/48, В.И. Жуков, В.М. Кривоносов, Л.А. Бондаренко и др. "Способ определения кожно-резорбтивного действия химических веществ. " Изобретения, 1992, N 30, с. 181 - прототип), основанного на обработке сыворотки крови и мочи 0,5%-ным раствором перекиси водорода с последующим измерением интенсивности сверхслабого свечения биологической жидкости до и после обработки. По изменению интенсивности слабого свечения определяют кожно-резорбтивное действие химических веществ. Однако с помощью способа-прототипа невозможно выявить характер повреждающего действия внутри организма, происшедшего после нанесения вещества на кожу, а также провести прогноз происходящих адаптационно-компенсаторных процессов или процессов, приводящих к усилению интоксикации, а значит поражению организма. С этой точки зрения предлагаемый способ может быть успешно применен при установлении диагноза о глубине поражающего действия ОВ и необходимости проведения соответствующей терапии в стационарных условиях лечения. Задачей настоящего изобретения является оценка микросомальной системы печени при действии на организм малых доз кожно-нарывных ОВ, повышение качества исследований за счет определения параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные процессы организма. Поставленная задача достигается тем, что по динамике концентрации фармзонда в крови оценивают активность микросомальных ферментов печени, участвующих в его детоксикации до и после воздействия вещества на организм. Отличие данного изобретения от способа-прототипа состоит в том, что в способе-прототипе биологическая жидкость обрабатывается 0,5%-ным раствором перекиси водорода и по измерению интенсивности сверхслабого свечения биоматериала определяется кожно-резорбтивное действие химических веществ. Использование же фармзонда позволяет характеризовать адаптационно-компенсаторные процессы, происходящие в печени по разнице в элиминации фармзонда до и после воздействия ОВ с привлечением жидкостной обращенно-фазовой хроматографии, предоставляет судить о характере повреждающего фактора (химического) на организм в целом, что приводит к улучшению качества анализа заявляемого способа, объективной оценки процессов, происходящих в организме уже в первые сутки при реальном действии малых доз вещества, а также дает возможность провести наблюдение за биообъектом до полного его выздоровления в течение всего периода интоксикации. Эксперименты проведены на крысах в опытах in vivo. Кровь для анализа отбирали из подъязычной вены через 1, 2, 4, 7 ч после внутрибрюшинного введения фармзонда. В качестве фармзонда обоснован карбамазепин, лекарственный препарат, относящийся к противоэпилептическим средствам, детоксикация которого проходит по эпоксиддиольному пути. Оптимизацию параметров хроматографического разделения карбамазепина проводили в условиях жидкостной обращенно-фазовой хроматографии с использованием колонок КАХ-2 с неполярной неподвижной фазой "Сепарон С18" на жидкостном хроматографе "Милихром-1" отечественного производства. В качестве элюента использовали водно-метаноловый раствор в соотношении 55/45 об.ед. Скорость потока составляла 30 мкл/мин. Детектирование производили с помощью ультрафиолетового детектора при![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/955.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/183.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/2/21099.gif)
Формула изобретения
Способ оценки микросомальной системы печени при действии ксенобиотиков алкилирующего типа, включающий нанесение ксенобиотика на кожу животного, забор и исследование пробы крови, отличающийся тем, что перед нанесением ксенобиотика животному вводят фармзонд карбамазепин, к полученной плазме крови добавляют кислоту при постоянном перемешивании, затем добавляют хлороформ и избыточное количество сульфата аммония, отделяют осадок с последующим упариванием экстракта до сухого остатка при (42![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4