Способ определения вируса везикулярного стоматита
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА, заключающийся во внесении вирусосодержащей пробы в культуру клеток-мишеней с : последующим учетом результатов, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве .клеток-мишеней используют неактивированные макрофаги зрелых белых крыс дикой линии, а учет результатов проводят по количеству выделенного макрофагами лизоцима.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
09) 01) Э(5б С 12 К 1 04
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОР НОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТ8ЕНКЫЙ КОМИТЕТ СССР
llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И (ЛНРЫТИЙ (21) 3521470/28-13 (22) 10. 12. 82 (46) 15.12.84. Бюл. Р 46 (72) А.СД1аронов (71) Владивостокский государственный медицинский институт (53) 616.31(088.8) (56) 1. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и реккетсиозных болезней. Под ред. П.Ф.Здродовского и М.И.Соколова, N. "Медицина", 1965, с. 77-79 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА
ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА, заключающийся во внесении вирусосодершащей пробы в культуру клеток-мишеней с последующим учетом результатов, о т- л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве .клеток-мишеней используют неактивированные макроАаги зрелых белых крыс дикой линии, а учет результатов проводят по количеству выделенного макрофагами лизоцима.
1129231 2
Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии, и может быть использовано для идентификации и количественного определения вируса везикулярного стомати- 5 ма (ВВС).
Известен способ определения вируса везикулярного стоматита, заключающийся во внесении вирусосодержащей пробы в культуру клеток-мишеней с последующим учетом результатов (I).
Однако известный способ сложен при выполнении и требует больших затрат времени.
Цель изобретения — упрощение способа.
Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения вируса везикулярного стоматита, заключающемуся во внесении вирусосодер- 20 жащей пробы в культуру клеток-мишеней с последующим учетом результатов, в качестве клеток-мишеней используют неактивированние макрофаги зрелых белых крыс дикой линии, а учет результатов проводят по количеству выделенного макрофагами лизоцима.
Способ выполняется следующим образом. 30
Отличительной бсобенностью способа является замена клеток-мишеней: фибробласты, чувствительные к цитопатическому действию ВВС, заменены перитонеальными макрофагами, способ- 35 ными быстро отвечать на воздействие
ВВС выбросом лизоцима. Последние довольно легко получают из перитонеальной полости крыс, мышей, разводят до оптимальной концентрации 40
2х10 кл/мл и вносят в стерильные
6 флаконы. После 30 мин микрофаги плот-, но прикрепляются к поверхности посуды, неприлипшие клетки удаляют от.мыванием. Период образования моно- 45 слоя сокращается..
Ф 1 вирусосодержащий материал берет ся в любом одном разведении или в неразведенном виде).
После идентичного этапа инфицирования клеток-мишеней различными дозами вирусов эффект вирусов может быть учтен уже через 2 ч. При этом учет результата реакции производят по количеству выброшенного лизоцима через 6-8 ч после начала постановки реакции, максимум через сутки, Лизоцим определяют микровариантом по 55
Н.С.Мотавкиной.
Пример. Определение количест ва ВВС в реакции выброса лизоцима
I макрофаг ами. Перитонеальные макройаги получают путем смыва средой с гепарином из перитонеальной полости животного известным способом. Клетки подсчитывают в камере Горяева и вводят в стерильные флаконы с плоским дном по 0,4 мл (в зависимости от объема флакона) в концентрации
2х10 кл/мл. Через 30 мин инкубации
6 клеток при комнатной температуре флаконы промывают средой для удаления неприлипших клеток.
В опытные флаконы вносят по 0,4 мл различных разведений вируссодержащего материала на 40 мин (табл. 1).
В первом контроле в ряд флаконов с макрофагами вносят двукратные разведения ВВС (исходная доза 10 ТЦД5).
Вторым контролем являются не обработанные вирусами клетки-мишени.
По истечении времени инфицирования флаконы однократно промывают культуральной средой и заливают той же средой по 0,4 мл все флаконы.
Реакция идет в течение 2 ч при 37 С, после чего производят определение активности лизоцима в надклеточной среде микрометодом Е.С.Матавкиной.
Для этого суточную культуру Micrococcus lisodeicticus в концентрации
300-500 микр. тел/мл смешивают с равным объемом 2Х расплавленной агарозы и заливают в камеру, состоящую из двух фотопластин и П-образной прокладки между ними. В застывшем геле вырезают лунки гель-пробойником, в которые капилляром вносят равные объемы исследуемого на лизоцим материала. Результат на содержание лизоцима учитывается через 2 ч инкубации при 37 С во влажной камере по зоне лизиса тест-бактерий. Максимальное разведение вирусосодержащего материала-, вызывающее видимый выброс лизоцима макрофагами, является титром р акции. Количество ВВС может быть выражено через результат действия различных разведений известного
ВВС (контроль Р 1) в единице ТЦД О.
Идентификация ВВС в реакции торможения выброса лизоцима макрофагами (определение присутствия ВВС в исследуемом материале) . Проводится ме4 тодом в соответствии со схемой, приведенной в табл. 1 с небольшими изменениями (в опыте и в контроле
Таблица 1
Макрофаги в концейтрации
2х1 0 кл/мл, мл
0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Инкубация 30 мин при комнатной температуре, промывка культуральной средой
Вирусосодержащий материал, мл
0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:
:1280
0,4 0,4.
1:10 1:20
Культуральная среда,мл
0 ° 4
ВВС исходная доза 10 ТЦЛ мл
50" по 0,4
Инкубация 40 мин при комнатной температуре, промывка культуральной средой 1-2 раза
Культуральная среда,мл
0,4 0,4 0,4- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Инкубация при 37 С 2 ч
Постановка микрометода определения лизоцима в надклеточной среде в течение 2 ч
Учет результата по наличию лизоцима
+++ +++ +++ ++ ++ ++ + +++
П р и м е ч а н и е. Титр реакции представленного результата 1:640.
3 11
Для специфической идентификации .
ВВС метод ставится в соответствии со схемой, приведенной в табл. 2 (схема постановки реакции торможения выброса лизоцима микрофагами).
Использование предлагаемого способа сокращает время идентификации
29231 4 и определения количества ВВС в
10 раз, значительно упрощает спбсоб титровання и индентификации
ВИС, что предполагает возможность его постановки даже s неспециализированной лаборатории.
1)29231
Т а б л и ц а 2
Ингредиенты
Опыт
Контроль 4акроФаги в концентрации
2х10 кл/мл, мл
0,4
0,4
0,4
Инкубация 30 мин при комнатной температуре, промь»вка средой Вирусосодержащий материал. обработанный в течение 30"60 мин рабочей дозой антнсыворотки к ВВС, мл
0,4
0,4
:Не обработанный антисывороткой вирусосодержащнй материал, мл
0,4
Инкубация 40 мин при комнатной температуре, промывка средой 1-2 раза
Культуральная среда, мл . 0,4 0,4 0,4
Инкубация при 37 С 2 ч
Постановка микрометода определения лизоцима в надклеточной среде в течение 2 ч
Учет результата по наличию лиэоцима
П р и м е ч а н и е. Указанный результат свидетельствует о наличии
ВВС в вирусосодержащем материале. При отсутствии
ВВС в вирусосодержащем материале наблюдается отрицательньй результат на лизоцим как в опыте, так и обоих контролях.
Редактор О.Колесникова
Заказ 9304/20 Тираж 521 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
- 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Известный ВВС, обработанный в течение 30-60 мин антисывороткой к ВЯС, мл
»
Составитель П.Бонарцев
Техред М.Кузьма Корректор И Иуска
