Плотная диагностическая питательная среда и способ ее получения

 

Изобретение относится к прикладной биотехнологии и микробиологии. Сущность изобретения: плотная диагностическая питательная среда для качественного и количественного анализа энтеробактерий содержит источники азота, лактозу, маннит, минеральные соли, красители и воду. В качестве красителей используют нейтральный красный и бромтимоловый синий. В качестве минеральных солей используют 30-50% NaCl, 5-6% Na₂HPO₄12 H₂O, 10-15% (NaH₄)₂SO₄, 25-40% K₂SO₄, 5-6% MgSO₄7 H₂O, 2-3 % Na₂CO₃. Соотношение ингредиентов /г/л/: минеральные соли 7.5-9.5, лактоза 8-12, маннит 0.3-0.7, нейтральный красный 0.03-0.05, бромтимоловый синий 0.01-0.03, агар-агар 5-10, вода остальное. Способ получения плотной диагностической питательной среды предусматривает смешение агара с красителями и минеральными солями. Далее полученную смесь растворяют в дистиллированной воде, кипятят, (фильтруют, доводят pH до 7.0-7.2, стерилизуют и затем смешивают с предварительно простерилизованным раствором лактозы и маннита с pH 7.0-7.2. Изобретение обеспечивает качественный и количественный анализ широкой группы бактерий при снижении сроков анализа. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к прикладной биотехнологии, а именно к микробиологии, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве.

Известно применение для диагностики бактерий в различных жидких и полужидких средах.

В частности, для диагностики E. coIi и сальмонелл применяют желчный бульон, среды Раппопорта, Мюллера, Штерна и т.д. [1].

Недостатком указанных сред является невозможность их применения для широкого круга микроорганизмов и для проведения количественных исследований. С целью сочетания качественного и количественного анализа в практике используют, как правило, плотные питательные среды такие, как среда Эндо (мясопептонный агар с лактозой, фуксином и сульфитом натрия) для определения кишечной палочки, сальмонелл и шигелл; среда Левина - для протей и кишечной палочки (агар с эозиноном и метиленовым синим), среда с солями резурина и т. д. (Каталог питательных сред, выпускаемых в СССР, Махачкала, 1992; В.Г. Иванов, Ю.Н. Шихалеев. Ветеринария, 1979, N 11, с. 74).

Недостатком указанных сред является узкий спектр микроорганизмов, которые могут быть диагностированы.

Ближайшим аналогом изобретения является среда Левина, включающая агар, красители (метиленовый синий, эозин), углеводы (лактозу, сахарозу) и соли (K₂HPO₄) [2].

Среду готовят введением в агар-агар красителей с последующим введением смеси лактозы, сахарозы и солей. Среда используется для количественного и качественного анализа кишечной палочки, E.coli - в малиново-красный, Citrobacter - в оранжево-красный, Klebsiella - красноватый или не изменяет цвета, Hafnia - красный, Proteus - грязно-зеленый, Salmonella - лимонно-зеленый, стафилококки и стрептококки цвета не меняют.

Данная плотная диагностическая среда может быть использована для проведения следующих бактериологических исследований: выделение бактерий из патологического материала, определение бакобсемененности, видового состава и количественного состава микрофлоры сыпучих материалов, жидкостей и воздуха.

Указанные граничные интервалы компонентов являются оптимальными, так как их изменение либо снижает эффективность роста микроорганизмов, либо ухудшает эксплуатационные характеристики среды, например плотность геля, прозрачность и т.п.

Способ получения среды, ее эффективность и возможность практического применения иллюстрируется примерами.

Пример 1. Приготовление питательных сред, получивших шифр ВБВ (содержание компонентов среды г/л).

8 г агар-агара смешивают с 0.02 г бромтимолового синего, 0.04 г нейтрального красного, после чего добавляют 3,5 г NaCl, 0,2 г Na₂CO₃, 0,4 г Na₂HPO₄12H₂O, 2,3 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г K₂SO₄, 0,4 г MgSO₄7H₂O.

Смесь растворяют в дистиллированной воде до 700 мл, кипятят 5-7 мин, фильтруют через марлю. Затем доводят pH до 7.0-7.2 0.1 н. раствором едкого натра и стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение часа. Одновременно готовят смесь 10 г лактозы и 0.5 г маннита, разводят дистиллированной водой до 300 мл, доводят pH до 7.0 - 7.2 и стерилизуют текучим паром в течение 1 ч. Охлажденные до 50 - 60^oC растворы смешивают при контроле pH в вышеуказанном интервале, перемешивают и стерильно разливают по 3 мл в пробирки, по 20 мл в чашки Петри, по 3 - 10 мл в пластиковые чашки Петри или по 0.3-0.5 мл в луночные планшеты в каждую лунку. При этом чашки и планшеты культивируют в положении агаром вниз.

Пример 2. В условиях примера 1 готовят минимальные и максимальные по составу среды. Состав полученных сред приведен в табл. 1.

Пример 3. Проведение бактериологических исследований. Выделение бактерий из патологического материала. Высевы проводят пастеровской пипеткой на поверхность среды чашки Петри. Для этого наносят капли физиологического раствора на поверхность агара, затем той же пипеткой делают укол в исследуемый орган трупа или другого материала и полученный изолят переносят в каплю физиологического раствора на поверхности среды. Затем стерильным шпателем каплю распределяют по всей поверхности агара. Инкубируют при 37^oC 24 ч.

Определение обсемененности и видового состава микрофлоры кормов, примексов, мясо-костной муки, продуктов питания и других материалов.

Для исследования берут навески образцов и делают их последовательные разведения, кратные 10. Из разведений делают посевы на среду ВБВ (0.1 мл материала) в чашках Петри. Инкубируют при 27^oC 24 ч.

Определение обсемененности воды и других жидкостей.

Разведение проб производят в физиологическом растворе, кратное 10. Посевы делают из разведений 0.1 мл материала на среду ВБВ в чашках Петри. Инкубируют при 37^oC 24 ч.

Определение обсемененности воздуха в животноводческих помещениях.

Для анализа готовят среду ВБВ в чашках Петри. В исследуемом помещении 5 чашек со средой открывают, разместив их на расстоянии 50 - 100 см от пола, и держат их открытыми в течение различного времени: 1-ю чашку - 5 мин, 2-ю - 10 мин, 3-ю - 20 мин, 4-ю - 40 мин, 5-ю - 1 ч 20 мин.

При сильном бактериальном загрязнении можно инкубировать чашки в течение 5 и 10 мин. Затем чашки закрывают и инкубируют в термостате при 37^oC 24 ч.

Результаты опытов приведены в табл. 2.

Анализы воздуха были проведены в свинарнике совхоза Красносельский (Ленинградская область) по указанной методике. Данные приведены в табл. 3.

По вышеуказанной методике был проведен анализ жидкой искусственной смеси бактерий на средах разного состава. Результаты приведены в табл. 4 и 5.

Пример 4. В условиях примера 1 готовили среды с использованием солей-заменителей. Состав полученных сред представлен в табл. 6.

Во всех опытах наблюдалось изменение цвета в местах роста бактерий в зависимости от их вида:
E.coli - малиново-красный,
Citrobacter - оранжево-красный,
Klebsiella - цвет не изменяется, или среда приобретает легкий красный оттенок,
Hafnia - красный,
Proteus - грязно-зеленый, характерная форма колоний,
Salmonella - лимонно-зеленый.

Стафилококки и стрептококки, как правило, не изменяют цвета среды, поэтому для более полного анализа некоторые колонии можно исследовать микроскопически и приготовить мазки бактерий для морфологического исследования.

Формула изобретения

1. Плотная диагностическая питательная среда для качественного и количественного анализа энтеробактерий, содержащая источники азота, лактозу, дополнительный углевод, минеральные соли, воду, агар-агар и красители, отличающаяся тем, что в качестве дополнительного углевода она содержит маннит, в качестве красителей нейтральный красный и бромтимоловый синий при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Минеральные соли 7,5 9,5
Лактоза 8 12
Маннит 0,3 0,7
Нейтральный красный 0,03 0,05
Бромтимоловый синий 0,01 0,03
Агар-агар 5 10
Вода Остальное
2. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве минеральных солей она содержит 30 50% NaCl, 5 6% Na₂HPO₄ 12H₂O, 10 - 15% (NH₄)₂SO₄, 25 40% K₂SO₄, 5 6% MgSO₄ 7H₂O, 2 3% Na₂CO₃ от общего количества минеральных солей.

3. Способ получения плотной диагностической питательной среды для качественного и количественного анализа энтеробактерий, включающий смешивание компонентов среды, стерилизацию, отличающийся тем, что проводят смешивание агара с красителями и минеральными солями, далее полученную смесь растворяют в дистиллированной воде, кипятят, фильтруют, доводят pН до 7,0 7,2, стерилизуют и затем смешивают с предварительно простерилизованным раствором лактозы и маннита с pН 7,0 7,2.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3