Устройство для экстракции и очистки нуклеиновых кислот (микронк)

Полезная модель предназначена для осуществления одной из базовых стадий анализа нуклеиновых кислот (НК) - выделение и очистка НК. Полезная модель представляет собой новое поколение устройств для выделения очистки, и анализа биомолекул, основанное на принципах максимальной миниатюризации, относительной простоты, комплексности и автоматизации процедур анализа, позволяющая при дальнейшем усовершенствовании, реализовать новейшую концепцию «лаборатории-на-чипе». Полезная модель позволяет резко снизить расход реактивов и расходных материалов, а его модификации позволяют проводить контроль за ходом процессов осуществляемых в устройстве. Относительная дешевизна производства и эксплуатации устройства позволяют в дальнейшем осуществить переход к одноразовому принципу в его эксплуатации, что открывает комплекс новых возможностей и вариантов применений устройства, особенно, при постепенном внедрении современных подходов индивидуальной медицины в здравоохранении. Среди признаков, обеспечивающих важнейшие преимущества полезной модели, необходимо отметить не только оригинальное устройство и компоновку составных частей устройства, но и использование современных оригинальных микро- и нанотехнологий в конструировании, изготовлении и использовании устройства. При изготовлении устройства микроНК применяются сконструированные оригинальные фотомаски, комплекс подробно описанных в работе методик получения шаблонов с использованием технологий мокрого травления фоторезистора SU-8 на кремниевой подложке. Затем осуществляются процедуры фиксации полученной картины, заливки шаблонов полидиметилсилоксановой смолой с отвердителем, прогреванием и конечной фиксации блока на подложке. МикроНК блок состоит из группы парных (8 в ряду) миниреакторов, связанных микроканальцами, позволяющих осуществлять полный цикл выделения и очистки НК с использованием технологии парамагнитных наночастиц и последовательных процедур лизиса, удаления примесных компонентов промыванием наночастиц и элюции на конечном этапе чистых препаратов НК. Устройство позволяет осуществлять процесс, практически без контакта с внешней средой, резко снижая опасность контаминации, а также осуществлять одновременную обработку от 1 до 96 образцов. Устройство, будучи относительно простым в изготовлении и эксплуатации, позволяет многократно повысить общую эффективность процедуры выделения и очистки НК при сохранении качества препаратов. Предлагаемое устройство позволяет существенно снизить стоимость процедуры в расчете на один образец, что является критически важным во многих областях применений, как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях НК.

Уровень техники

Существенным недостатком современных методик анализа нуклеиновых кислот (далее - НК) являются длительные, трудоемкий и относительно дорогие процедуры и их выделения. До сих пор актуальной проблемой при анализе НК являются именно начальные процедуры выделения препаратов ДНК, которые часто определяют дельнейшие процедуры анализа. Распространенные ручные методики, в настоящее время, требующие длительных и трудоемких процедур, центрифугирования, лизиса клеток и тканей, в ряде случаев используются стадии обработки депротеинизирующими агентами - токсичным фенолом или протеиназной НК с многочасовыми инкубациями [1]. Таким образом, недостатками ручных процедур являются трудоемкость, недостаточно высокий выход НК, частое использование токсичных органических растворителей, риск заражения персонала при работе с патогенными микроорганизмами. Весьма актуально, в связи с этим, создание высокоэффективных технологий выделения и очистки нуклеиновых кислот и, что особенно актуально, технологии последующего анализа нуклеиновых кислот, от простого электрофореза до возможного полиморфного и экспрессионного анализа.

Можно указать несколько вариантов успешной автоматизации процедур выделения, очистки и первичных этапов анализа НК. Среди них роботизированные системы COBAS AmpliPrep компании Roche Diagnostics (США/Швейцария), Thermo KingFisher компании Thermo Electron (США), QIAsymphony SP и BioRobot MDx компании Qiagen (Германия), предназначенные для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических жидкостей, использующей магнитные частицы в традиционных микроколонках. Все эти системы позволяют одновременно обрабатывать несколько биологических образцов, для выделения вирусных НК или геномной ДНК. Система QIAsymphony SP включает картриджи, заполненные необходимыми реагентами, дозировано подаваемые для обработки образца. Картриджи автоматизированы и не требуют ручных операций, что очень важно для исключения возможной контаминации при работе с бактериальными и вирусными патогенами.

Известны также рабочие станции для автоматической экстракции и очистки НК, которые с использованием роботов воспроизводят ручные способы выделения НК, включающие последовательное перемещение пробирок, фильтрацию, дозирование реагентов. Например, компанией Bioneer Corp. заявлено устройство для автоматической очистки ДНК (Automatic DNA purification apparatus, патент WO/2001/025482), состоящее из ряда соединенных друг с другом каналами контейнеров с растворами, клапанов для регуляции потоков, вакуумного блока, штативов, систем точного введения растворов в виде шприцов.

Компанией Corbett Technologies (Австралия) разработана настольная рабочая станция "X-tractor GeneTM System" для экстракции НК из образцов объемом до 200 мкл, полностью воспроизводящая ручное выделение НК.

Перечисленные устройства очень сложны, основаны на применении робототехники, их важнейшими недостатками являются их громоздкость, высокая стоимость (более 70000.00$), к тому же требуются, дорогие реактивы и вспомогательные материалы для проведения анализов и эксплуатации. Системы очень специфичны и требуют только реактивов, расходных материалов и деталей только фирмы поставщика.

Существует еще ряд запатентованных технологий, общими недостатками которых являются достаточно часто используемые ручные этапы и наличие стадий центрифугирования. В частности, фирма Millipore Corporation (США) запатентовано устройство для выделения НК из клеток, вирусных частиц и бактерий, включающее систему пористых мембран, через которые последовательно пропускается образец [Filter device for the isolation of a nucleic acid, EP 183242 A2]. Мембраны соединены системой клапанов. Устройство может масштабироваться путем объединения в кассеты.

В другом примере устройство для выделения НК [Nucleic acid isolation, WO/2005/012521, Invitrogen Corp., США] включает последовательно соединенные картридж в виде пробирки, фильтрующий элемент и колонку для очистки НК. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса.

Предлагаемое устройство для выделения НК позволяет проводить практически в автоматическом режиме все основные стадии процесса, лизиса клеток и тканей, очистку и элюцию НК. Преимуществом предлагаемых методик является возможность практически полного исключения контакта персонала с биологическими образцами, за исключением процедуры взятия образца и доставки его в лабораторию, что не входит непосредственно в процедуры выделения НК. На рис.1 (вид сверху) и рис. 2 (медиальное вертикальное сечение) представлены принципиальные схемы сменного блока с набором мини- или микрореакторов для последовательных операций лизиса, отмывки от примесей и элюции чистых препаратов НК. Блок включает 2 группы миниреакторов для лизиса (1.2) и для промывания и элюции парамагнитных наночастиц (1.3). Группы миниреакторов соединены попарно микроканальцами (1.7; 1.8; 2.7; 2.8) (содержащих, или не содержащих микрофильтры) (1.9; 2.9), а также соединены с внешней средой специальным распределительным устройством. Миниреакторы для промывки и элюции НК снабжены входящими и исходящими канальцами и, соответственно, индивидуальными портами для введения исходных буферов и растворов (1.1), и для удаления продуктов промывания, и отбора на конечной стадии очищенных НК (1.4). Так как каждый миниреактор может избирательно закрываться и открываться специальными заглушками (2.6), блок позволяет одновременно, в своей максимальной комплектации, выделять от 1-ой до 48 или 96 проб в соответствии со стандартными планшетами для современных приборов для осуществления процедуры полимеразой цепной реакции с возможностью контроля накопления продукта в реальном времени (далее - РТ ПЦР), блоки скрепляются друг с другом и тс деталью обеспечения сбора и удаления отходов процедуры выделения и очистки НК простым механическим зажимом (2.5).

Предлагаемая версия полезного устройств для микро процедур выделения НК и все его заявляемые модификации лишены всех, или большинства вышеуказанных недостатков ручных полуавтоматических устройств для выделения НК. Это новое поколение устройств для выделения, очистки и анализа биомолекул, основанное на принципах максимальной миниатюризации, относительной простоты, комплексности и автоматизации процедур, позволяющая, при дальнейшем усовершенствовании, реализовать новейшую концепцию «лаборатории-на-чипе» и создать новые технологии молекулярной диагностики и анализа в медицине и исследовании окружающей среды.

Кроме очевидного для представляемого устройства выигрыша в необходимости очень малых (в порядки) количеств анализируемого материала, существенного увеличения скорости анализа, резкого снижения расхода реактивов при сохранении эффективности выделения и очистки предлагаемое устройство, в его более сложных модификациях, позволяет создавать комплексные устройства, позволяющие осуществлять дальнейшие аналитических процедуры, включая разделение и сложные виды анализа, осуществлять контроль за процессом разделения, проводить предобработки образцов перед анализом, или проведение различных реакций в целях осуществления тонких видов анализа продуктов разделения.

Полезное устройство позволяет осуществлять выделение и очистку НК из большого спектра биологических образцов, включая патогенны. Для выделения и очистки НК используется система в виде блока, включающего труппу мини- микрорезервуаров и микроканальцев. Сама процедура выделения и очистки основывается на применении парамагнитных наночастиц и серии последовательно используемых лизирующих биологический материал и промывающих растворов для удаления примесей, а также конечного элюирующего буфера. Устройство может быть использовано в различных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работах, биомедицине, после серии запланированных определенных доработок, и усовершенствований путем добавления аналитических блоков к устройству. Устройство так же может быть использовано в медицинской диагностике, диагностике патогенов человека, животных и растений.

Целью является создание устройств для выделения и очистки, с использованием основ микрофлюидных технологий, стандартной технологии фотолитографии и мягкой литографии. Разработаны и реализованы в предлагаемом устройстве основополагающие методы конструирования, изготовления и способов использования сложных микроНК устройств с высоким уровнем функциональности и позволяющих достигать высокого уровня и эффективности очистки биомолекул. Преимуществом разработанного устройства является высокая эффективность, скорость очистки, микроколичеств необходимого материала, относительная дешевизна, большая функциональность и возможность последовательного функционального усложнения.

Сущность полезной модели

Предлагаемое полезная модель относится к новому уровню конструирования, производства и использования микроаналитических устройств выделения и очистки НК (микроНК) для практически всех стадий традиционного анализа биомолекул, включая ДНК, РНК и белки.

Устройство для осуществления первых этапов выделения и очистки НК включает в себя систему микроканальцев (входящий и исходящий и миниреактор, в котором осуществляется процедуры выделения и очистки НК. В реактор по отдельному вертикальному каналу подается образец, следом подается по микроканальцам лизирующий раствор из уже подключенных последовательно емкостей, затем из верхнего канала или по отдельному микроканалу подаются магнитные частицы, осуществляется последовательные процедуры сорбции ДНК, удаления примесных компонентов тканей или клеток и, на последней стадии осуществляются элюция. Перемешивание магнитных наночастиц, в соответствие с традиционной, классической макрометодикой, осуществляется в миниреакторе с реагентами через внешнее регулируемое магнитное устройство путем его вращения или изменения полярности.

Производство устройства для микроНК осуществляется с использованием принципа микромасштабирования и протравливания специальных слоев фоторезиста на кремниевой подложке с последующим осуществлением процедур мягкой литографии. Предлагаемая полезная модель включает в себя следующие базовые технологические блоки и методики их изготовления: I. а) Базовая подложка и методики нанесения фоторезиста (SU-8 2000), его засвечивания, протравливания и фиксации; II. Блока для выделения и очистки НК, состоящего из одного или нескольких параллельно расположенных миниреакторов для выделения НК на подложке в слое фоторезиста; III. Процедуру получения штампа в процессе мягкой литографии с использованием вариантов полидиметилсилоксана (далее - PDSM) или полиметилметакрилата (далее - PMMA) и формируемую систему микроканальцев.

В предлагаемом варианте полезного устройства элементы устройства включают несколько слоев, последовательно наносимых друг на друга и подвергающихся различным процедурам «микротравления». В качестве материала слоев или базовой подложки используются, например, кремний, стекло, пластик, кварц, керамики или металл. Различные компоненты устройства связаны друг с другом жидкостной связью, в качестве сил передвигающих жидкости выступают подаваемое извне давление медленным перистальтическим насосом (или отсасывание) или с использованием внутренних устройств различного типа для создания управляемых потоков жидкостей.

Основные аспекты производства микроустройства для выделения и очистки НК связаны со способом его изготовления. Устройство при конструировании и изготовлении включает разработку и применение цикла процедур, включая: 1. Этап подготовки фотомаски, базового субстрата и его обработки; 2. Нанесение слоя фоторезиста (SU-8) на указанный базовый слой субстрата. 3. Проведение процедуры удаления указанного слоя фоторезиста с оригинальными методами травления для производства капиллярных каналов и миниреакторов для проведения процедуры микроНК.

В качестве вариантов материала основной подложки платформы используются кремний, стекло, пластмассы (PDMS или PMMA), металл, керамика или кварц. В качестве слоя пассивации используется термические оксиды или наслаиваемый слой фоторезиста (SU-8). В качестве вариантов базового слоя и верхнего слоя используется материал PDMS или PMMA.

Для улучшения текучести каналы обрабатывают соединениями повышающими их гидрофильность. Варианты конструирования и производства полезного устройства не ограничиваются каким либо одним материалом, то есть могут использоваться кремний, стекло, пластик, кварц, керамика и металл, однако, предпочтение отдается все же, кремнию при производстве платформы.

В качестве преимущественного материала для базового и верхнего слоя являются PDMS и PMMA. PDMS и PMMA являются поддающимися формованию удобным и эффективным материалом для производства основных базовых структурных элементов микроустройств, создаваемых на основе микрофлюидных технологий. Метод не ограничивается использованием какого-то одного материала в качестве слоя фоторезиста. В предпочтительном варианте, в качестве фоторезиста используется SU-8. Настоящее полезное устройство при производстве базового элемента не ограничивается каким-либо конкретным средством травления или методом травления фоторезиста после процедуры экспонирования. В качестве преимущественного метода травления для получения шаблонов использовали метод мокрого травления.

Предлагаемое устройство и комплекс технологий его применений основывается на новейших микрофлюидных и нанотехнологиях в создании аналитических микроустройств, а частности устройств включающих систему микроканальцев и минирекаторов для выделения и очистки НК и последующих процедур анализа биомолекул.

Сравнительный анализ с близким аналогом.

Близким аналогом в части блока для микроНК для выделения и очистки НК можно указать «Устройство для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот» 84381.

Признаки аналога, совпадающие с существующими признаками заявленной полезной модели: а) сходным является наличие миникамер для осуществления всего цикла процедур выделения и очистки НК; б) наличие нескольких минирезервуаров для осуществления отдельных важных этапов процедуры; в) наличие портов подачи исходных растворов и буферов и портов удаления отходов процедуры; г) использование электромагнитных полей для перемещения, перемешивания смесей и буферов; д) практически полное отсутствие контакта персонала с биологическими образцами; е) использование твердофазного сорбента для избирательного связывания НК из лизатов клеток и тканей. По самой методике выделения и очистки НК совпадающими признаками являются:

а) лизис клеток и тканей в лизирующем буфере, содержащем различные хаотропные агенты; б) избирательная сорбция из лизатов НК компонента на твердофазных сорбентах; в) отмывание примесных компонентов с использованием специальных растворов; г) элюция чистых препаратов ДНК от твердофазного носителя специально подобранными буферами.

Признаки, отличающие заявленную полезную модель от аналога и обеспечивающие его преимущества. Можно выделить большой спектр преимуществ предлагаемого комплексного устройства микроНК над взятым для сравнения близким аналогом, в частности: а) возможность одновременно выделять ДНК из 1 до 96 различных биологических проб, при сохранении качества получаемых препаратов ДНК; б) устройство существенно проще в управлении, так как не требуется подключение компьютера и сложных программ; в) намного меньшего расхода реактивов и существенная дешевизна производства и эксплуатации устройства с возможностью перехода на одноразовый режим использования; г) существенно меньше стадий, когда требуется термостатирование образцов; д) не требуется применять сложных буферов на различных стадиях и применимость стандартных продажных буферов (Силекс М, http://sileks.com/ru/). Таким образом, технический результат в предлагаемом блоке для выделения и очистки НК комплексного устройства - микроНК является повышение эффективности очистки, удобства в эксплуатации и упрощения конструкции при одновременном сохранении качества получаемых препаратов ДНК и сокпащение материальных затрат.

I. Принципиальные основы конструирования и производства устройства для выделения и очистки НК.

Предлагаемое полезное устройство для выделения и очистки НК изготовлено на базовой платформе. Платформа может быть изготовлена из кремния, стекла, пластмассы, металла, металлокерамики или из любых совместимых соединений. В преимущественных вариантах в качестве базовой платформы используется кремний, так как кремний является более доступным и технологически и экономически выгодным материалом. Кремний является материалом, используемым для изготовления микроэлектронных устройств и технологии их изготовления хорошо отработаны в последние годы.

Хотя использованная для производства устройства технология в своем базовом варианте была изначально предназначена для создания микроэлектронных устройств, практически те же методы достаточно широко используются в настоящее время для создания большого спектра микромеханических систем. Для создания потока жидкости в микроканальцах были использованы специализированные, расположенные «вне чипа» микронасосы и микродозаторы. [2, 3].

Необходимо отметить дополнительные преимущества кремния в качестве материала базовой подложки, так как последний имеет хорошие механические характеристики, облегчающие его обработку. Экономическая привлекательность устройств, создаваемых на основе кремния и современных технологий мягкой литографии, заключается в том, что эти технологии микрообработки, по сути, являются методиками аналогичными процедурам, используемым при проявлении фотографий. Сущность основных этапов изготовления устройства, заключается в тщательном конструировании и изготовлении прозрачных фотомасок, содержащих непрозрачный сконструированный узор микроконструкций для «фотомечения» объектов на поверхности специально подобранных фоторезистов (SU-8). Узоры, нанесенные при засвечивании на фоторезист, после процедур протравливания и фиксации позволяют получать структуры специально сконструированных шаблонов для получения микроканальцев и миниреакторов различной формы и размеров. После того, как шаблон создан, он может быть использован для множественного производств практически идентичных платформ для создания микроустройств. Следовательно, даже сложные микроустройства могут быть воспроизведены в массовых количествах и с низкими дополнительными удельными затратами, конечно, при условии, что все компоненты будут совместимы с кремнием и его технологиями микрообработки.

Разработанные и отлаженные технологии изготовления оригинального устройства для микроНК позволяют обойти некоторые проблемы совместимости с кремнием, используя его в качестве базовой платформы. Основополагающий вариант осуществления технологии создания устройства заключается в применении кремния в качестве базовой платформы, на которой наносится базовый слой. Далее, наносится дополнительный защитный слой . Затем наносится толстый слой фоторезиста SU-8 нужной маркировки, с последующими стадиями засвечивания протравливания и удаления незасвеченных участков фоторезиста.

При производстве устройства могут быть использованы различные методики как изотропного, так и анизотропного травления реактивами жидкого или газообразного состава, которые позволяют получать мини, микрореакторы и микноканалы требуемой глубины травления с четким боковыми стенками. Рисунок  микроканалов определяется специальными «фотомасками» с нанесенным с помощью специальных принтеров «узором». Характер узоров микроканалов и микрореакторов определяется заранее составленными с помощью специализированных компьютерных программ рисунками и количество вариантов при конструировании устройств практически неограниченно. С помощью контролируемого травления можно также производить входные отверстия, которые проходят насквозь через подложку, обеспечивая доступ к микрореакторам и канальцам с внешней поверхности устройства через специальные порты, подключаемые, в свою очередь, при необходимости к различным внешним устройствам и приборам.

II. Технологии производства и обеспечения функционирования устройства для выделения НК и обработки микрореакторов и микроканальцев и конструирование различных вариантов устройства.

Перед использованием устройства до начала процедур выделения и очистки НК, миниреакторы и миниканальцы устройства обрабатывают путем промывания основаниями, кислотами, буфером, деионизованной водой и различными соединениями для повышения гидрофильности, а затем относительно высокими концентрациями растворов нейтральных неспецифических белков.

Базовые и перспективные варианты предлагаемых устройств включают:

Устройство по п. I отличающееся тем, что полезное устройство включает один или более блоков выделения и очистки НК с использованием парамагнитных наночастиц, встроенной системы для использования в качестве составляющих компонентов комплексного устройства микроНК.

Устройство по п. I отличающееся тем, что полезное устройство объединяет микноканалы и встроенную систему детекции с использованием принципов фотоники и использования PDSM и/или PMMA конструкций. Каналы создаются путем наслаивания верхнего слоя, например, PDMS над слоем протравленного и термически обработанного фоторезиста (SU-8) определенного размерами используемого геля.

Для равномерной защиты компонентов любой конфигурации на таких разнообразных субстратах, как металл, стекло, бумага, смолы, пластика, керамики, феррита и кремния используются различные композитные пластмассы, в частности пирален. Благодаря своим уникальным свойствам, пирален покрывает поверхности практически любой формы, в том числе острые кромки, трещины (в том числе слой фоторезиста), или плоские и выступающие внутренние поверхности.

После травления отверстий для запуска потока жидкости в верхнем слое, участки необлученного фоторезиста SU-8 удаляют, высвобождая миниреакторы и микноканалы для выделения и очистки и детекции НК. Или полученную конструкцию используют в качестве шаблона для получения блоков из фотополимеризующегося композитного пластика PDSM и/или PMMA. Травление осуществляется с помощью специальных фирменных составов, предназначенных для травления использованного фоторезиста (SU-8).

Для конструирования вертикальных входных отверстий при проведении процедуры мягкой литографии встраиваются специальные шаблоны в виде тонких стержней. Селективное жидкостное травление удаляет предназначенный для удаления слой фоторезиста, но не наложенный (верхний слой) или базовый слой подкладки (базовый уровень).

Примеры технологии производства блоков устройства микроНК и его применения.

I. Пример технологий производства PDMS и PMMA блоков для методик выделения и очистки НК.

Получение нового поколения высокоэффективных технологичных и относительно недорогих (в перспективе одноразовых) микрофлюидных устройств включает в себя три основные стадии: а) конструирование на специализированных компьютерных программах фотомасок; б) заказ распечатанных на специализированных принтерах на стекле или прозрачных пленках фотомасок на специализирующихся в данных областях фирмах; в) нанесение слоя фоторезиста SU-8 на кремниевую (или любую другую пригодную подложку), фотозасвечивание фоторезиста и протравливание для получения шаблона. Затем проведение процедур заливки шаблона PDMS или PMMA смолой и его фотополимеризация, отделение PDMS или PMMA от шаблона. После удаления слоя затвердевшего PDMS или PMMA, SU-8 шаблон может быть использован многократно. Таким образом, именно стадия получения SU-8 шаблона является наиболее трудоемкой, а получение самих PDMS или PMMA слоев для создания блоков заявленных микроустройств занимает всего нескольких минут с последующими 2 часами прогревания.

II. Получение PDMS слоев путем заливки полученных SU-8 шаблонов.

PDMS смолу с соответствующим фирменным отвердителем заливают в специально подготовленную конструкцию с шаблоном и проводят следующие операции:

Смешивают коммерчески доступную смолу PDMS (Sylgard 184) в пластиковой емкости в соотношении 10:1 по весу с фирменным отвердителем.

Покрывают шаблон, находящийся в специальной миницентрифуге, так, чтобы покрывать стержни, предназначенные для сообщения блоков PDMS при центрифугировании (толщина слоя должна быть в пределах 100 микрон, условия центрифугирования 200 об/мин в течение 20 секунд, и при 850 об/мин в течение 60 секунд).

Прогревают конструкцию в боксе в течение 2 часов при 70°C.

Медленно охлаждают конструкцию.

III. Снятие слоя PDMS и склеивание конструкции с подложкой

Снятие PDMS довольно сложный процесс, так как возможна деформация при неосторожном обращении и длительном стоянии на воздухе. Для предотвращения деформации используется метанол. При этом необходимы следующие манипуляции:

Высвобождают край слоя скальпелем, погружают всю конструкцию в метанол и осторожно отделяют с одной стороны слой PDMS конструкции с покачиваниями. Слой при этом оставляют в метаноле.

Хранят слой PDMS в метаноле и осторожно подкладывают под него базовую кремниевую подложку, тщательно отмытую и обезжиренную.

Удаляют слой PDMS с подложкой и совмещают его под увеличивающим бинокулярном или микроскопом, подливая на поверхность метанол.

Осторожно удаляют излишки метанола и высушивают совмещенную конструкции на воздухе.

IV. Процедуры временного или постоянного склеивания PDMS слоя и подложки.

Проведенные выше процедуры приводят к временному склеиванию PDMS слоя и подложки через Ван-дер-Ваальсовые силы. PDMS слой может быть при этом осторожно снят и перемещен (желательно также с использованием метанола). Постоянное склеивание возможно путем обработки PDMS слоя в кислородной плазме.

Пример конструирования и использования устройства для выделения и очистки НК.

Использование микрофлюидных устройств и прамагнитных наночастиц для выделения и очистки НК является в настоящее время самым высокотехнологичным и эффективным подходом из всех существующих. Парамагнитные частицы успешно применяются в самых различных вариантах «макро-методик». Однако все они достаточно трудоемки, длительны и требуют много расходных материалов. К тому же существует опасность контаминаций, что важно при диагностике патогенов. В своем полном варианте, предлагаемая технология микроНК, требует только нанесения биологического образца, все остальные операции происходят в закрытой миникамер соответствующего блока устройства. Возможность конструирования множества параллельных миникамер с подводящими и отводящими микроканальцами, при значительной дешевизне массового производства микрофлюидных микроНК устройств, позволяет осуществлять процедуры по одноразовой технологии, что также является большим преимуществом методики. Еще одним преимуществом является возможность при дальнейшем усовершенствовании устройства и создании дополнительного блока для разделения НК проводить процесс в одном устройстве, не извлекая очищенный образец ДНК, что крайне облегчает общую процедуру анализа, существенно ее ускоряет и резко снижает опасность контаминаций.

Процедура выделения включает 4 стадии: а) лизиса клеток в миниреакторе специальным лизирующем буфере, содержащем додецилсульфат натрия (SDS), NaCl и гуанидинхлорид; б) связывания ДНК на парамагнитных частицах, добавленных в лизат через соответствующий порт для нанесения; в) удаления примесей и нежелательных для последующих анализов ДНК компонентов с помощью соответствующего буфера и г) снятие чистой ДНК от парамагнитных частиц с помощью чистого ТЕ буфера, приготовленного на milliQ воде. Все буфера, растворы и парамагнитные частицы поставлялись фирмой «Силекс М» (http://sileks.com/ru/).

Конструкция устройства в комплексном микрофлюидном устройстве включает 4 основных элемента (рис.1 и 2): а) входные порты для нанесения образцов (1.2; 2.2), парамагнитных частиц и конечного буфера ТЕ для элюции ДНК (1.3; 2.3); б) циркулярную миникамеру для лизиса (2.10) и очистки и экстракции чистых препаратов ДНК (2.6); в) входящие микроканальца для последовательно используемых буферов лизиса и промывания (1.7; 2.7) и исходящие микроканальца для удаления примесей (1.8; 2.8); г) исходящий порт (1.4; 2.4), открывающийся в конце процедуры для извлечения очищенных препаратов ДНК или РНК, или подключаемый к блоку для микроЭФ через входящий микроканал. Оценка эффективности процедуры показала, в среднем, 1,5-2,0 кратное увеличение выхода ДНК в расчете на 1 мкл суспензии наночастиц и одинакового количества исходного биологического материала.

Изготовление устройства для выделения НК.

Двумерную схему для изготовления фотомаски конструировали с использованием компьютерных программ CAD или Cle Win (www.wieweb.com). Затем с использованием заказанных в специализированных фирмах фотомасок изготавливали фотошаблоны на основе фоторезиста SU-8, либо, в случае применения двухступенчатого процесса изготовления основных конструкций, с использованием полиэфиримида (далее - PEI). Полученный негативный вторичный шаблон использовали для получения конечных PMMA деталей блока. Блок состоит из нескольких деталей, включая 2 ряда миниреакторов в количестве 8 в каждом ряду со средним объемом 40-50 мкл и подающими и отводящими растворы деталями. Перемешивание парамагнитных частиц адсорбирующих НК и металлических частиц для перемешивания и разрушения клеток и тканей на всех этапах выделения и очистки ДНК осуществлялись с помощью специально подобранного вращающегося постоянного магнитика (минимагнитной мешалки), причем направление вращения магнитика направлено навстречу потокам промывающих и элюирующих жидкостей в микроканальцах.

Процедура выделения и очистки НК.

Процедура лизиса включала перемешивание 10 мкл образца с равным объемом лизирующего буфера в течение 5 мин, перевод лизата через миниканал в примыкающий миниреактор, содержащий парамагнитные наночастицы, для осуществления процедур связывания НК, удаления примесей и конечной элюции очищенных НК. После инкубации в течение 5 минут с парамагнитными частицами, осуществляли последовательные процедуры отмывания частиц от примесей тремя последовательно используемыми буферами (Силекс М, http://sileks.com/ru/). Конечная элюция осуществляется буфером с низкой ионной силой на воде градации milliQ путем инкубации отсоединенного блока миниреакторов от блока устройства 5 мин при 60°C.

Литература:

1. Goldenberg D., Perschil I., Ritzler M., et al. A simple "universal" DNA extraction procedure using SDS and proteinase K is compatible with direct PCR amplification. Genome Res., 1995, v.4: p.368-370

2. Laser D. J. and Santiago J.G. A review of micropumps. J. Micromech. Microeng., 2004, v.14, R35-R64.

3. Самарин А. Миниатюрные линейные пьезоэлектрические двигатели. Компоненты и технологии. 2006, 10, с.36-41.

Устройство для экстракции и очистки нуклеиновых кислот, включающее объединенные в блок мини-камеры для осуществления цикла процедур выделения и очистки нуклеиновых кислот, мини-резервуары для осуществления отдельных этапов процедуры, порты с микроканалами подачи исходных растворов и буферов и порты удаления отходов, по меньшей мере 2 ряда соединенных микроканалами мини-реакторов для осуществления последовательных операций лизиса, экстракции, промывания и элюции чистых препаратов нуклеиновых кислот с возможностью применения парамагнитных наночастиц и внешнего вращающегося постоянного минимагнита для перемешивания, исходный порт для извлечения очищенных препаратов ДНК или РНК.