Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов
Союз Советсиих
Социалистических
Ресттубпии
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
I ./ .г б °,- (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 21.01.80 (21) 2873327/30-15 (5()М. Кл. С 01 N 33/48 С 01 N 33/52 с прнсоелинением заявки Рй ЪВ дяРстааккъЮ камитат СССР йв делам изобретений и открытий (23) П риоритет Опубликовано 23.02.82. Бюллетень М 7 Дата опубликования описания 25.02.82 (53) УДК 543: 547. 915(088.8) (72) Авторы изобретения Б. А. Ломсадзе, Ю. А. Владимиров, N. А. Царцидзе, О. С. Джишкариани и М. П. Мардалейшвили Тбилисский ордена Трудового Красного Знамени 1 государственный университет (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО КОЛИЧЕСТВА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ фОСФОЛИПИДОВ Изобретение относится к биохимии и химии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипи- дов в крови, в органах животных, например, печени, а также в опухоли. Известен способ определения коли5 чества фосфолипидов, включающих выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавлсние к раствору фосфолипидов водного раствора красителя 10 оранжевого кислотного, смесь разделяют отстаиванием в делительной воронке и определение количества фосфолипидов по количеству перешедшего в органическую фазу красителя (1 1. Недостатками этого способа являют, ся большая трудоемкость. Раствор красителя вносят в мицеллу в несколько приемов, а смесь отделяют отстаиванием после внесения каждой пробы и продолжительность процесса определения (30-60 мин), а также невозможность определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов. Цель изобретения - разработка способа определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов и повышение точности определения. Поставлен lая цель достигается тем, что для растворения фосфолипидов используют четыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3,2-10 -6.10 тМ концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе. Пример. Липиды экстрагировали 20-ти кратным объемом смеси хлороформметанопа 2:1, два раза смесью (,1:1} и затем осадок заливали этой же смесью (1:1! и оставляли на ночь. На следующий день экстракция пипилоя 90 проводилась еще дважды смесью хлороформметанола (2:1) . Объединенные липидные экстракты отмывали от водорастворимых примесей охлажденным раствором 0,3 Н NaC1 добавляемым с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не 6олее 503 спирта (дабы он не извлекал фосфолипиды). После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывался. Пленка, образующаяся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенный и водно-спиртовый) растворялась добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды упаривали под вакуумом досуха при комнатной температуре. Общее количество липидов определяли весовым методом, сухой остаток растворяли в органическом растворителе — четыреххлористом углероде — СС1, из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 2 мг липида. Процесс выделения липидов и определения их в них суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов проводили при стандартных условиях (комнатная температура — 1820 С, давление - 760 мм рт. ст..) о К фосфолипидам, растворенным в СС1 добавляют водный раствор акридинового оранжевого, разделяют органическую и водную фазы отстаиванием в делительной воронке и измеряют интенсивность поглощения красителя в органической и в водной фазах. Вычисляют коэффициент распределения красителя между двумя фазами и опредеПолученное количество фосфатидилинозита, мкг Ошибка опыта, Наименование способа 114 1 7 Таблица2 Ошибка опыта, 1 Полученное количество фосфатидилинозита, мкг 3,2-10 4 10 3,4 1,7 4,2 116 118 11 6 -10 Тонкослойная хроматография Способ определения отрицательно заряженных фосфолипидов Концентрация акридинового оранжевого, моль 74 4 4 ляют количество отрицательно заряженных фосфолипидов по стандартной кривой. Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфолипидов. Коэффициент распределения красителя между двумя фазами определяют по формуле Ц 10 н а I (4n) где ВСС вЂ” оптическая плотность краф сителя в органической 15 фазе; - оптическая плотность кра« сителя в водной фазе; ф Л) - концентрация фосфолипидов. Продолжительность процесса определения 5-10 мин при 18-20 С. Сравнительные данные определения заданного (например, 12i3 мкг) количества отрицательного заряженного фосфатидилинозита с помощью предла25 гаемого и известного способами приведены в табл. 1. Данные осуществления способа определения заданного (например, 120мкг,) количества отрицательно заряженного фосфатидилинозита при граничных и среднем значениях концентраций водного раствора красителя приведены в табл. 2. Использование предлагаемого способа определения отрицательно заряженных фосфолипидов обеспечивает быстроту и простоту определения, а также более высокую точность анализа в сравнении с известными способами. Т а б л и ц а 1 907434 Формула изобретения.Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов, включающий выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавление водного раствора красителя, разделение органической и водной фаз в делительной воронке и определение количества отрицательно заряженных фосфолипидов по степени распределения красителя между двумя фазами, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, для растворения фосфолипидов используют тыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3,2 ° 10 "- 6 ° 10 M концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР и 412548, кл. С О1 И 33/02, 06.03.72. Составитель Л. Рубинова Рецактор А» Шандор Техреду E. Харитончик Корректор м. Заказ 581/52 Тираж 883 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР пр делам изобретений и открытий 113035 Москва Ж-)5, Раушская наб. g. 4/ филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4