Способ получения изолимонной кислоты
- ч „
В.И..Илларионова, Л.И.Глазунова, Н.В.Шишканова, * """" -"
Т.В.Финогенова и А.Б.Лозинов
I .. -., с р4 !
Ы .,, -...,-, ф
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН CCCP (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОЬ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИИОННОЙ КИСЛОТЫ
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно .к способу получения изолимонной кислоты, используемой в раз- . личных отраслях промышленности, наS, пример медицинской, химической и др.
Изолимонная кислота метаболически близка лимонной кислоте и может найти применение в тех же областях ,народного хозяйства, где использу- 10 ется последняя, и производство которой не обеспечивает в достаточной степени потребности в ней (электррнная, металлургическая, текстильная промышленность; прН производстве поверхностно-активных веществ, а также синтетических моющих средств вместо триполифосфатов натрия и калия, загрязняющих фосфором водные 2в бассейны}. Изолимонная кислота ис.-. пользуется как биохимический препарат в исследовательной работе, однако . стоимость ее очень высока, 2 что значительно ограничивает области ее применения. . Известен способ получения изолимонной кислоты с использованием дрожжей вида Candida 1ipolytiñà, предусматривающий выращивание их на питательной среде при аэрации среды, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли (1). Наряду с изолимонной кислотой в ферментационной среде обнаруживают.и лимонную кислоту.
Известен также способ производства, изолимонной кислоты при культивиро- вании дрожжей Candida brumptii 1ГО
0744 в питательной среде с н-гексадеканом (60 г/л), получают 30,0 r/л иэолимонной кислоты (с выходом 503 от внесенного алкана), лимонной кислоты в среде не обнаруживают (-).
Наиболее близким техническим ре" шением к описываемому по достигаемому эффекту является способ получения
2,0 мл
3 84978 йзолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида- Candida lipoly"
tica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей этиловый спирт, в качестве единственного источника углерода, азот, фосфор и минеральные соли (3).
При культивировании дрожжей
Candida lipolytica на питательной среде, содержащей 2,03 этаноМ, вы- 1р ход изолимонной кислоты составляет
60-663 от внесенного субстрата.
Рассматриваемый способ не обеспечивает достаточно высокого выхода изолимонной кислоты. 15
Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода и концентрации изолимонной кислоты.
Поставленйая цель достигается тем, что в способе получения изолимонной кислоты, предусматривающем культивирование дрожжей аида Candida lipoly.tica s условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минераль- 2S ные соли, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор изоцитрат-лиазы в концентрации
1,0 66,0 мм.
При этом, в качестве ингибитора 3© используют итаконат или оксалат натрия, а в качестве источника углерода - нормальные парафины или этанол.
Использование предлагаемого способа позволит наладить производство изолимонной кислоты из вышеперечисленных источников углерода с выходом этого продукта, превышающим все известные достижения в этой области.
Добавление к ферментационной среде итаконата или оксалата даже в небольших концентрациях сдвигает соотношение накапливаемых в растворе лимонной и изолимонной кислот в сторону изо" лимонной, что облегчает процессы выделения в химочистки последней.
Пример 1. Дрожжи Cand da l i poly t i ca ИБИФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде
Ридер с нормальными алканами (С1 Сщ) имеющей следующий состав, г/л:
Нормальные алканы са- С 8,0 (NH у ) 504 3,0
Ид50 7Н О 0,7
КаС 1 0 5
Ca(Ц0 ) 0,4
Ю Р04 1,0
0 4
К НР01 0,1
Агар-агар 25,0
Дрожже вой автолизат
Смесь микроэлементов по
Буркгопьдеру 50мл
Набор микроэлементов по Буркголь" деру включает следующие"компоненты (мг/л среды):.К1-0,1; В - 0,01;
МФ+" 0,01 2п т- 0,01; СР - 0,01;
Дрожжи выращивают на скошенном агаре в течение двух сут при 28" 30 С., о
Водную суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы объемом
750 мп, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: н-гексадекан . 8,0 (NH44.
Ид50д. 7Н 0 0,7
НаС 0 5
Са(ЙО ) 0,4
КХНР.04 . О, 1
Тиамин 500 мкг
Смесь микроэлементов 5,0 мл
Выращивание проводят 48 ч на качалке (260 об/мин) при 28-30 С. Полученный посевной материал вносят в количестве 2Ф в среду для ферментации, которая осуществлялась также в колбах обьемом 750 мл с 50 мл среды аналогичного состава.
Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрия в различных концентрациях. рН среды поддеркивают 5,5-6,5 путем добавления 103 йаОН. В табл.1 приведены результаты, полученные после четырех сут культивирования.
Из таблицы видно, что добавление в среду итаконата приводит к изменению соотношения накапливаемых кислот в сторону изолимонной кислоты (по сравнению с контролем) и тем самым повышает выход последней от использованного субстрата.
ll р и м е р 2. Дрожжи Candida
1ipolytiña ИБФИ У-160 поддерживают и выращивают на питательной среде того же состава, как описано в примере 1.
Через 24 ч культивирования в опытные колбы вносят оксалат натрия в различных концентрациях. В табл.2 приведены результаты определения со90,0
2,4
1,4.0 5
0,8
2,0
0,2
3,5
500,0 мкг
5,0 мл
5 - 8497 держания в культуральной жидкости лимонных кислот после. 96 ч культивирования.
Полученные данные показывают, что использование оксалата также повышает $ выход изолиманной кислоты.
Пример 3.,Дрожжи Candida
liро1уйiса. ИБИФ У-160 поддерживают на агаризованной минеральной среде
Ридер, имеющей такой же состав,как в примере 1. В качестве источника углерода использукн этанол (10,0 г/л).
Культуру выращивают на скошенном агаре в течение трех сут при 28-30 С, Водную суспензию клеток с агаризован- 1$ ной среды переносят в колбы объемом .
750 мл, содержащие 50 мл посевной среды.
Среда для получения посевного ма": териала имеет следующий состав, г/л: 2В (W+) Мд50 7Н,О 0,7 NaC l 0,5 . Ca(но ) 2 0,4 КН, Р04 1,0 2$ К " 04, Этанол 10,0 Тиамин . 500 мкг Смесь микроэлементов 5,0 мл Выращивание проводят 48 ч на качалке(260 об/мин)при 28-30 С. Полученную посевную .культуру переносят в новую партию колб со средой того же состава в количестве 5Ж от объе" ма среды. Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрия в концентрации 5 мИ. рН среды во время культивирования поддержи- щ вали равным 5,5-6,5 введением раствора Na0H. Через 5 сут культивирования в среде накапливается 7,2 г изолймонной кислоты и 2,0 r лимонной кислоты в 1 л. Выход изолимонной кислоты составляет 723 от внесенного субстрата. В колбах без добавления итаконата обнаруживается 6,4 r изолимонной и 2,4 лимонной кислоты. Пример 4. Дрожжи Candida lipolytica И6ФИ У-lбо.выращивают на скошенном-агаре, как в примере 1. Водную суспензию клеток с агаризован«$$ ной среды переносят в колбы объемом 750 .мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: 80 6 Нормальные парафины (c„ - („ ) 24,0 (ИН ) 5а, 2,0 MgS04 7н,о 0,7 NaCl 0,5 Са (НО ) 0,4 кн Р04 l,0 К<НРО4 0 г1 Соль Мора .3 5мг Тиамин 500„9 мкг Смесь микроэле-. ментов 5,0 мл Через 48 ч инкубации на качалке (260 об/мин ) полученную посевную культуру переносят в новую партию колб с посевной средой, объем ино- кулюма - 5Ф от объема среды. 500 мл выросшей культуры переносят в ферментационную среду (3,5 л ) сле" . дующего состава, г/л: Нормальные парафины (С -С ) (нн4) 6о ид5ф7н о NaCl Ca(NО ) кнР04 К2НР04 Соль Иора Тиамин . Смесь микроэлементов Через 24 ч и 50 ч от начала кулв тивирования в ферментационную среду добавляют итаконат натрия в концентрации 5,0 г/л (конечная концентрация итаконата 10,0 г/л). ферментацию проводят в ферментационном аппарате -при постоянном перемешивании и поддержании концентрации кислорода в среде 75-853 насыщения. рН среды поддерживают на уров" не 5,5-6,5 введением раствора йаОН. Через 144 ч культивирования в среде накапливается 67,0 г/л изоли-.; монной кислоты и 29,0 г/л лимонной кислоты. Кроме того определено 23,4 г/л неиспользованного парафина. Выход изолимонной кислоты от потребленного субстрата составляет 1003. Соотношение лимонной и изолимонной кислот - 1:2,3 ° При проведении ферментации на питательной среде, содержащей 72,0 г/л нормальных парафинов без добавления итаконата, накапливается 48,5 с изолимонной кислоты (выход 67,34 от Итакойат натрия, мИ Измеряемый параметр Контроль Лимонная кислота, r/cP 2 5 Изолимонная кислота, г/л 6,0 6,4 62 68 50 5,0 Выход изолимонной / кислоты от субстрата, 62,5 62,5 75 62 Соотношение кислот лимонная:изо1:1,2 1:2 лимонная ««« ««««« «« Таблица 2.Измеряе парамет Контр Лимонная кислота,г/л 3,3 3 5 4,5 4,0 3,8 4,0 3.3 Изолимонная кислота, г/л 5 0 6,6 6,4 5,4 6,8 6,8 6,6 7 8 . субстрата ) и 54,0 лимонной кислоты. Соотношение кислот 1: 1. Пример 5. Выращивание дрожжей на скошенном агаре, получение. посевного материала и ферментационный процесс осуществляют, как в при,мере 2. Ферментационная среда содержит нормальные парафины С - С в концентрации 100,0 г/л. ю 9 Через 24 ч и 50 ч культивирования в среду вносили соответственно .. 2,0 г/л и 3,0 г/л итаконтата натрия (конечная концентрация итаконата - 5,0 г/л). После 144 ч культивирования в ферментационной среде обнаруживают 68,3 г/л изолимонной кислоты и 33,7 г/л лимонной кислоты). Концент" рация остаточного парафина в среде -, 37,8 г/л. Выход изолимонной кислоты от использованного. субстрата Составляет 109,83. Соотношение лимонной и изолимонной кислот равно 1:2. 49780 8 Выход лимонных кислот и их соотношение при культивировании дрожжей на среде без добавления итаконата был таким же, как описано в приме" з ре 4. Внесение в ферментационную среду итаконата или оксалата натрия в концентрациях от 1,0 до 6,Î мМ сдвигает соотношение экстретируемых 14 дрожжами лимонных кислот в сторону преимущественного накопления изолимонной кислоты, повышая, тем самым, ее концентрацию в ферментационном растворе, а это, в свою очередь,при1 водит к тому, что значительно облегчаются процессы выделения этой кислоты из раствора и последующей мим-. очистки. Использование данного способа позволит одновременно повысить 20 концентрацию изолимонной кислоты в растворе и ее выход, что приведет в снижению ее стоимости и расширению области ее применения. Т а б л и ц а 1 1,7 1,75 1,75 1,5 1,8 l:3,5 1:3,6 . 1:3,5 1:4,5 .1:3 849780 Продолжение табл. 2 J П. Измеряемый параметр Контроль 1 5 10 20 40 60 Выход изолимонной .кислоты от субстрата, Ф 85 82,5 62 5 68:. 82 5 80 Ь Соотношение кислот лимонная:изолимоннал 1: 1,2 1: l,2 1: 1,6 1: 1,7 1:2,1 1:2,1 l:1,9 Составитель М.Ларина Редактор Е.Зубистова Техред А. &абинец Корректор У.Пономаренко Заказ 10784/7 Тираж 521 Подписное 8НИИПИ Государственного комитета СССР flo делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 » Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, Формула изобретения 1. Способ полуумения изолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида Сапд1па lipolytica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, форфора и минеральные соли, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор иэоцит" рат-лиазы в концентрации.1,0"60,0 мМ. + 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем, что в качестве инги-. «»»ФЪ битора используют итаконат натрия или оксалат натрия. 3. Способ по и.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве источника углерн да используют нормальные парафины или этанол. Источники информации, принятые во внимание при,экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР Н 305187, w. С 12Э 1/04, 1968. 2. Патент Франции Н 1596056, кл. С 12 d опублик. 1970. 3. Авторское свидетельство СССР по заявке . 2844702/13, кл. С 12 Р 7/48, 1979.