Способ качественного определения смеси желчных кислот и их комплексов с таурином и глицерином

440600

15 го

КоКо п/и

Козффиниент

Кислота

Таурохолевая

Таурохенодезоксихолевая

Тауродезоксихолевая

Тауродитохолевая

Гликохолевая

Гликозенодезоксихолевая

Гликодезоксихолевая

Холевая

Хенодезок сихолевая

Дезоксихолевая

Литохолевая

2

4

5 б

8

О 13

0,20

0,25

0,28

0,41.

0,51

0,56

0,62

О,70

0,79

0,92

60 эфира, свободного от этилового спирта и перекисей, соединяют с воздушным холодильником, в просвет которого вставлена бумажка с нанесенной пробой, и экстрагируют в течение

10 минут на водяной бане при температуре

50 — 60 . Время экстракции отсчитывают с того момента, когда эфир начнет канать с клиновидно заостренного конца бумаги.

После экстракции эфиром меняют приемник на новый, в который наливают 1 мл 96 этилового спирта, соединяют приемник с воздушным холодильником (с оставшейся в нем бумажкой экстрагированной эфиром) и ведут экстракцию на кипящей водяной бане этанолом в течение 15 мин., считая с момента, когда спирт начнет капать с бумажки.

После окончания экстракции спиртом трубку воздушного холодильника вместе со вставленной в него бумажкой отсоединяют от приемника, а, имеющийся в- приемнике спирт выпаривают досуха на кипящей водяной бане.

Оставшийся после выпаривания сухой остаток используют для нанесения .на хроматографическую бумагу. С этой целью сухой остаток растворяют в 0,2 —.0,4 мл н-бутилового спирта и наносят на бумагу около 0,05 — 0,03 мл, высушивают. места-. нанесения и хроматографируют согласно указаниям, описанным ниже.

Хроматографическую бумагу разрезают вдоль волокон на плоскости шириной 30 мм и длиной 300 мм. На одном конце бумажной полоски карандашом чертят трапецию, нижнее основание которой равно 30 мм (ширина полоски), высота — 25 мм, а верхнее основание составляет 6 мм и переходит в полоску длиной

15.мм, которая затем на протяжении 25 мм постепенно конусообразно расширяется до

300,мм, (ширина полоски).

После этого бумажные полоски замачивают в.О;05 н-. растворе трилона Б, высушивают при

90 и.-путем нисходящей хроматографии (в лодочку вставляют размеченный конец бумаги) промывают в течение 36 — 48 час. 0,1 н. раствором аммиака. Затем бумагу сушат и промывают таким же способом в течение 48 часов смесью, состоящей из 3 частей бутана и

1 части уксусной ледяной кислоты, сушат под вытяжным шкафом до полного исчезновения запаха уксусной кислоты и сохраняют в сухом, защищенном, от пыли, месте. Перед хроматографией бумагу вырезают соответственно ранее сделанным разметкам, 20 мин. сушат при 105 С и затем наносят исследуемую пробу на образовавшийся перешеек в точку, расположенную в 5 мм от верхнего основания трапеции.

Хроматографирование ведут восходящим путем, в 250 мл мерных цилиндрах, закрытых обернутой в полиэтиленовую пленку резиновой пробкой (№ 36). На дно цилиндров налита подвижная смесь в количестве 7 — 10 мл, которую используют, многократно (хроматографируют

6 — 7 раз) и в течение недели она полностью сохраняет свои свойства. Для быстрого насыщения пространства камеры (цилиндра) парами подвижной фазы его закрывают пробкой и смачивают внутренние стенки налитой на дно смесью растворителей. После этого полоску бумаги с нанесенной пробой прикрепляют согнутой в крючок булавкой или скрепкой к резиновой пробке, обернутой полиэтиленовой пленкой, погружают на 2 — 3. мм в растворитель и герметически закрывают цилиндр при помощи той же пробки и лейкопластыря. Хроматографирование ведут при комнатной температуре дважды. После каждого хроматографирования бумагу высушивают 5 мин. при

105 С. Длительность одноразового хроматографирования равна примерно 6 — 7 час., при подъеме подвижной фазы на высоту в 225 мм от места нанесения пробы. После повторного хроматографирования сухую хроматограмму проводят через насыщенный хлороформенный раствор треххлористой сурьмы, нагревают

5 минут при 100 — 105 и пятна желчных кислот рассматривают в ультрафиолетовом свете, проходящем через фильтр Вуда. Коэффициенты при использовании предлагаемого состава подвижной фазы и нанесении.на хроматограм,му по 25 мкг отдельной желчной кислоты были следующими:

Указанным способом можно разделить 5—

150 мкг каждой кислоты.

Предмет изобретения

1. Способ качественного определения смеси желчных кислот и их комплексов с таурином и глицином путем нанесения анализируемой пробы на хроматографическую бумагу с последующим хроматографированием в системе лодвижных растворителей и идентификацией компонентов смеси обычным образом, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения анализа, в качестве растворителей используют смесь ледяная уксусная кислота — муравьиная кислота — гептан.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вышеуказанную смесь растворителей используют в следующих объемных соотношениях; толуол 3 — 4 об. части, ледяная уксусная кислота — 2,5 — 3,5 об, части, 85% -ная муравьиная кислота 0,3 — 0,5 об. части и гептан — 2,3 — 3,2 об; части,