Микробиологическое 11--гидроксилирование стероидов

 

Изобретение относится к биотехнологии. Способ микробиологического превращения стероида в его соответствующее 11-гидрокси производное in vitro предусматривает использование кислорода и микроорганизма, выбранного из Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus и Pestelona. При этом стероид имеет чистоту 90-97% и его концентрация в реакционной среде составляет, по крайней мере, 5 г/л. Способ позволяет повысить выход продукта. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к микробному способу 11-гидроксилирования стероидов.

Микробиологическое 11-гидроксилирование стероидов является хорошо известным способом как in vivo, так и in vitro. Например, об 11-гидроксилировании прогестерона препаратами свободных клеток Aspergillus ochraceus сообщалось Shibahara et al., Biochim. Biophys. Acta, 202 (1970), 172-179. Известно также, что микробиологические реакции 11-гидроксилирования стероидов являются непредсказуемыми и неизбежно ведут к неполному превращению. Обычно достигаются степени конверсии 80-85%. Однако для промышленного применения важно получить высокопредсказуемые степени конверсии, которыми предпочтительно являются выходы 11-гидроксилированных стероидов выше чем 95%. Математические модели оптимизации таких ферментационных процессов обсуждались Deshayes et al. Bull. Soc. Chim. Fr., (1980), II 24-34. Например, при 11-гидроксилировании канренона Deshayes обнаружил, что при оптимальных условиях выход больше 95% может быть достигнут, если Aspergillus ochraceus использовали в среде, содержащей приблизительно 10 г/л глюкозы в форме солодового экстракта и триптиказу. При таких условиях могло превратиться до 1,5 г/л канренона, что рассматривалось как улучшение известной практики, например, описанной Blunt et al., J. Chem. Soc., 6 (1971), 1136, который не мог получить выход 11-гидроксилированного канренона выше 90%, используя самое большее 0,5 г/л субстрата.

Поскольку можно было предполагать, что загрязнения оказывают вредное влияние на микробиологический процесс, можно было ожидать, что можно дополнительно улучшить процесс путем увеличения чистоты исходных материалов. Однако неожиданно было обнаружено, что дальнейшее улучшение достигается при использовании менее чистого субстрата, в особенности субстрата с чистотой ниже 97%. Поэтому настоящее изобретение относится к микробиологическому способу превращения стероида в его соответствующее 11-гидрокси производное in vitro при использовании кислорода и микроорганизма, выбранного из Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus и штаммов Pestelona, характеризующемуся тем, что используется стероид с чистотой менее 97%.

Предпочтительными являются микроорганизмы Aspergillus ochraceus. Чистота стероида предпочтительно выше 90%. Более предпочтительна чистота стероида между 90 и 95%. Настоящий способ, использующий неочищенные субстраты,обеспечивает микробиологическое превращение при концентрациях субстрата, которые значительно выше, чем максимальные концентрации, описанные Blunt или Deshayes.

Настоящий микробный метод может быть применен для стероидов, имеющих незамещенное 11-положение. Предпочтительными примерами являются эстра-4-ен-3,17-дион и канренон.

Неожиданное влияние загрязнений на степень превращения показано в следующих таблицах.

Далее изобретение поясняется следующими примерами.

Примеры Пример 1 Колбу для встряхивания, содержащую минеральную среду роста с глюкозой засеивали спорами A.ochraceus и помещали на качалку при 28^oС на 15 ч. После этого ферментер с мешалкой, содержащий 5 л среды, инокулировали 250 мл суспензии проросших спор. Используемая среда содержала среду с глюкозой и экстрактом дрожжей (глюкоза 40 г/л, экстракт дрожжей 10 г/л, рН 5.0). Условия выращивания были следующими: скорость мешалки 750 об/мин, поток воздуха 0,2 л/л/мин, температура 28^oС. Вспенивание замеряли антивспенивательным электродом и контролировали (подавляли) автоматическим добавлением антивспенивающего агента на основе силикона. После того как культура имела концентрацию биомассы по меньшей мере 2 г/л, добавляли небольшую порцию эстра-4-ен-3,17-диона (1 г/л), чтобы вызвать синтез гидроксилирующих ферментов. Спустя 3 часа добавляли более высокие концентрации стероида, чтобы достичь желаемых концентраций, которые приведены в таблице 1. Превращение стероида останавливали, когда прекращали наблюдать увеличение конверсии.

Пример 2 В колбе для встряхивания готовили такую же культуру, как описано в Примере 1. После того как культура имела концентрацию биомассы по меньшей мере 4 г/л, за один прием добавляли канренон, чтобы достичь желаемых концентраций, которые приведены в таблице 2. Превращение стероида останавливали, когда прекращали наблюдать увеличение конверсии.

Все перечисленные в описании микроорганизмы являются широко используемыми в данной области гидроксилаторами. Штаммы Pestalotia populi nigrae (коммерческое название CBS353.51) и Pestalotia foedans (ATCC 11817) являются известными микроорганизмами, используемыми для получения ряда стероидов (см. US 2721163, 18.10.1955). Указанные в патенте США штаммы микроорганизмов культивировали в условиях согласно изобретению, при этом использовали субстрат со степенью чистоты 96%. Выход продукта, как и ожидалось, составил 95%.

Таким образом, все микроорганизмы, которые могут быть использованы в качестве гидроксилаторов в данной области, приемлемы для изобретения. Сущность изобретения заключается не в подборе микроорганизмов, а в определении условий культивирования, необходимых для повышения эффективности конверсии.

Формула изобретения

1. Микробиологический способ превращения стероида в его соответствующее 11--гидрокси производное in vitro при использовании кислорода и микроорганизма, выбранного из Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus и Pestelona, в котором указанный стероид выбирают из экстра-4-ен-3,17-диона и канренона, причем указанный стероид имеет чистоту менее чем 97% и более чем 90% и этот стероид используют в концентрации, по крайней мере, 5 г/л.

2. Способ по п. 1, в котором указанный микроорганизм представляет собой Aspergillus ochraceus.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный стероид имеет чистоту 90-95%.

РИСУНКИ

Рисунок 1