Двойные ингибиторы no-синтазы и циклооксигеназы, способ их получения, фармацевтическая композиция на их основе

 

Изобретение касается соединений общей формулы AB, которые могут быть солями или амидами, в которых A обозначает ингибитор циклооксигеназы, имеющий доступную кислотную функциональную группу, а В обозначает L-форму аналогов аргинина формулы: где R₁, R₂ и R₃ являются различными заместителями, а также способа получения таких соединений и их фармацевтических композиций. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 8 табл.

Изобретение относится к соединениям с двойной биологической активностью, к способу их получения и к фармацевтической композиции на их основе.

Предлагаемые соединения являются двойными ингибиторами метаболизма L-Аргинин/окиси азота (NO) и циклооксигеназы.

Принимая во внимание потенциальную роль NO-синтазы и циклооксигеназы в развитии физиопатологии, соединения-ингибиторы обеспечивают благоприятный эффект при лечении сердечно-сосудистых и церебрососудистых нарушений, включая, например, мигрень, шоки, инфаркт, ишемию, септические, эндотоксические и геморрагические шоки, боли; воспаления различных видов, включая, например, ревматические кризы, ревматический артрит и другие типы артритов, остеоартроз, астму; иммунных заболеваний, включая вирусные и невирусные инфекции, аутоиммунные заболевания, токсикоманию, рак и другие патологии, связанные с избыточным выделением окиси азота и/или метаболитов арахидоновой кислоты у человека или животных.

Ингибиторы циклооксигеназы или аспириноподобные лекарства, например, ацетилсалициловая и салициловая кислоты, метилированные производные индола, такие, как индометацин (DCI 1-(4-хлорбензол)-5- метокси-2-метил-1Н-индол-3-уксусной кислоты) и сулиндак (DCI 5-фтор- 2-метил-1-[[4-(метил-сульфинил)фенил] -метилен] -1Н-инден-3-уксусной кислоты), производные N-фенил-антраниловой кислоты (меклофенамат, фенамат), производные пропионовой кислоты, такие, как ибупрофен (DCI п-изобутилгидротроповой кислоты), напроксен и фенопрофен, широко применяются (правда, с некоторыми нежелательными побочными эффектами при больших дозах) в качестве эффективных противовоспалительных средств (см. R.Flower, S.Moncada и J.Vane, Mechanism of action of aspirin-like drugs - In the pharmacological basis of therapeutics Goodman и Gilman 1985, 29, 674-715). Кроме того, эти соединения применяют при приступах мигрени и для ее профилактики. Значение этих лекарств несомненно, хотя их терапевтическая реакция часто несовершенна, и у некоторых пациентов они не дают адекватного лечения. Учитывая их противовоспалительные и антитромбозные свойства, эти соединения применяют при тромбозах и для снятия отека при мозговой ишемии, а в последнее время их предлагают для лечения и профилактики инфарктов, припадков и церебрососудистых заболеваний (W.Armstrong Recent trends in research and treatment of stroke. SCRIP, PJB публикации. 1991).

Биологическая активность ингибиторов NO-синтазы была обнаружена только недавно, а их терапевтическое применение исследуется. Эти вещества, структура которых аналогична структуре L-Аргинина и раскрыта в заявке на патент Великобритании N 9028013.2, являются ингибиторами образования окиси азота (NO). Исчерпывающая современная информация об окиси азота NO представлена в документе (S. Moncada, R.M.J. Palmer, E.A.Higgs. Окись азота: физиология, патофизиология и фармакология. Pharmacological reviews 43, 2, 109- 142, 1991). Из него ясно, что NO является механизмом трансдукции растворимой гуанилатциклазы в сосудистую систему, в тромбоциты, нервную систему, а также эффекторной молекулой в иммунологических реакциях во многих клетках и тканях, включая макрофаги и нейтрофилы. NO генерируется из L-Аргинина ферментом, называемым NO-синтазой. Этот фермент существует в двух формах: конструктивной и индуцибильной, которые ингибируются аналогами L-Агринина, определенными ниже. При некоторых патологиях выделяется избыточное количество NO, как это показано на примере шока в упомянутой выше заявке на патент. В этом контексте ингибиторы NO-синтазы являются эффективными лекарствами, предупреждающими сосудистые заболевания, особенно при объединении этих ингибиторов с ингибиторами циклооксигеназы, такими как аспирин, индометацин или меклофенамат. Такое благотворное действие комбинации двух активных начал в одной молекуле обнаружено при лечении пациентов, страдающих от мигрени, припадков, инфарктов, церебральной ишемии, болей, воспалений и различных иммунологических заболеваний. Ассоциация ингибитора NO-синтазы и ингибитора циклооксигеназы раскрыта в упомянутой выше патентной заявке и в заявке Великобритании N 2240041 для лечения шоковых состояний. Однако заявитель обнаружил, что ассоциаты таких соединений обеспечивают лучший синергический эффект, чем их смесь.

Таким образом, изобретение относится к двойным ингибиторам NO - синтазы и циклооксигеназы общей формулы 1: где A обозначает группу формулы: или группу формулы где R является радикалом ингибитора циклооксигеназы, выбранным из салицилатов, фенаматов, производных бензолуксусной кислоты, индометацина или сулиндака; R₁ является атомом водорода, метил, этил; R₂ является атомом водорода, нитрогруппа; R₃ является амино-, метиламиногруппой,
при условии, что если A является группой а R₂ - атом водорода, то R₃ не является аминогруппой.

Предпочтительными соединениями являются соединения формулы 1, где R является радикалом салициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты, мефенамиковой кислоты, ибупрофена, индометацина и сулиндака.

Предпочтительными соединениями являются также соединения формулы 1, в которой A является группой формулы:

где R имеет вышеуказанные значения;
или соединения формулы 1, в которой А является группой формулы:

где R имеет вышеуказанные значения.

Изобретение относится также к способу получения двойных ингибиторов NO-синтазы и циклооксигеназы формулы 1, заключающемуся в том, что соединения формулы II:
R COOH (II),
где R имеет вышеуказанные значения, или его соль, или соединение формулы III:
R COX (III),
где X обозначает атом галогена, подвергают взаимодействию с соединением формулы IV:

где R₁, R₂, R₃ имеют вышеуказанные значения, или его солью, в эквимолярном количестве.

Взаимодействие осуществляют в воде или смеси воды и спирта при температуре от комнатной до температуры кипения реакционной смеси, или в ацетонитриле при температуре от 0^oC до комнатной в присутствии основания.

Солью соединения формулы II может быть, например, натриевая соль. Солью соединения формулы IV может быть, например, ацетат или гидрохлорид. Спирт, используемый в смеси с водой, может быть метанолом или этанолом.

При работе в ацентонитриле при температуре от 0^oC до комнатной в присутствии основания с использованием соединения формулы III солью соединения формулы IV может быть, например, гидрохлорид этого соединения. Реакцию можно проводить в присутствии триэтиламина в качестве основания.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество соединения общей формулы I в смеси с фармацевтически пригодным разбавителем или носителем.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Соединение формулы I в виде соли N-монометил-L- аргинина (L-NMMA) с ацетилсалициловой кислотой.

99 мг (0,52 ммоля) L-NMMA и 95 мг (0,52 ммоля) ацетилсалициловой кислоты растворяют в 10 мл этанола (95%) при комнатной температуре. Раствор перемешивают в течение трех часов при комнатной температуре. Затем раствор концентрируют досуха, и полученный остаток обрабатывают 25 мл воды, затем лиофилизуют, получая 190 мг целевого соединения (белое твердое вещество, т.пл. 170^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,80-6,60 (м, 4Н, ароматика); 3,50 (т, 1Н, CHCO₂H); 3,10 (м, 2H, CH₂- NH); 2,60 (c, 3H, CH-NH); 2,15 (c, 3H, CH₃-CO), 1,90-1,30 (м, 4H, CH-CH₂-CH₂).

Пример 2. Соединение формулы I в виде соли N-монометил-L- аргинина (L-NMMA) с салициловой кислотой.

0,52 ммоля N-монометил-L-аргининацетата и 0,52 ммоля натриевой соли салициловой кислоты растворяют в воде при комнатной температуре. Раствор перемешивают при комнатной температуре до тех пор, пока он не станет прозрачным. Образовавшийся ацетат натрия выделяют, и раствор лиофилизуют, получая 160 мг целевого соединения (белое твердое вещество, т.пл. 172-175^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,75-6,70 (м, 4Н, ароматика); 3,55 (т, 1Н, CH-COOH); 3,00 (м, 2H, CH₂-NH); 2,60 (c, 3H, NH-CH₃); 1,90-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 3. Соединение формулы I в виде соли N--нитро-L- аргинина (L-NO) с ацетилсалициловой кислотой.

500 мг (2,28 ммоля) N--нитро-L-аргинина и 411 мг (2,28 ммоля) ацетилсалициловой кислоты растворяют в смеси этанол/H₂О (100 мл/79 мл) при нагревании. В течение одного часа раствор перемешивают при кипячении с обратным холодильником. Раствор концентрируют досуха, получая остаток, который обрабатывают 100 мл воды, затем лиофилизуют, получая 900 мл целевого соединения (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,85-6,70 (м, 4Н, ароматика); 3,70 (т, 1Н, CH-COOH); 3,10 (м, 2H, CH₂-NH); 2,16 (c, 3H, CH₃); 1,90-1,35 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 4. Соединение формулы 1 в виде соли N--нитро-L- аргинина (L-NO) с салициловой кислотой.

500 мг (2,28 ммоля) N--нитро-L-аргинина и 315 мг (2,28 ммоля) салициловой кислоты растворяют в смеси этанол/H₂О (100 мл/70 мл) при нагревании. Перемешивание продолжают в течение одного часа при кипячении с обратным холодильником. Раствор концентрируют досуха, и полученный остаток обрабатывают 100 мл воды, затем лиофилизуют, получая 810 мл целевого соединения (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,78-6,71 (м, 4Н, ароматика); 3,53 (т, 1Н, CH-COOH); 3,11 (м, 2H, CH₂-NH); 2,00-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 5. Соединение формулы I в виде соли метилового эфира N--нитро-L-аргинина (L-NAME) с ацетилсалициловой кислотой.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств ацетилсалициловой кислоты и метилового эфира N--нитро-L-аргинина в соответствии с методом, описанным в примере 3 (выход 98,7%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,8-6,7 (м, 4Н, Ph); 3,80 (т, 1Н, CH-COOH); 3,65 (c, 3H, CO₂CH₃); 3,10 (м, 2H, CH₂-NH); 2,11 (c, 3H, CH₃CO); 1,90-1,35 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 6. Соединение формулы I в виде соли с N--нитро-L-аргинина (L-NO) с индометацином.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств индометацина и N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 3 (выход 97,8%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,70-6,35 (м, 7Н, ароматика); 3,95 (м, 1Н, CH-COOH); 3,62 (c, 3H, CH₃O); 3,35 (c, 2H, CH₂COOH), 3,08 (м, 2H, CH₂-NH); 2,10 (2c, 3H, CH₃-C=); 1,72-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 7. Соединение AB в виде соли N--метил-L-аргинина (L- NMMA) с сулиндаком.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств натриевой соли сулиндака и ацетата N--метил-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 2 (выход 98%); (оранжевое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,45 (м, 4H, Ph-SO), 6,95- 6,60 (м, 3Н, Ph-F); 6,29 (м, 1H, = CH), 3,15 (м, 5Н, CH-COOH, CH₂COOH, CH₂-NH); 2,72 (c, 3H, CH₃-NH), 2,60 (c, 3H, CH₃-SO), 1,83 (2c, 3H, CH₃-C=); 1,40 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 8. Соединение формулы I в виде соли N--нитро-L-аргинина (L-NO) с ибупрофеном.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств ибупрофена и N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 3 (выход 99%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7 (м, 4Н, ароматика); 3,6- 3,3 (м, 2Н, 2CH-C₂H), 3,05 (м, 2H, CH₂N); 2,35 (д, 2H, CH₂Ph), 1.8-1.3 (м, 5H, CH₂-CH₂ и CH(CH₃)₂); 1,2 (д, 3H, CH-CH₃); 0,9 (д, 6H, 2CH₃).

Пример 9. Соединение формулы I в виде соли N--нитро-L-аргинина (L-NO) с мефенамиковой кислотой.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств мефенамиковой кислоты и N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 3 (выход 98%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, CD₃ОD): 8 (м, 1Н, H ароматический в орто-положении к COOH); 7,3-6,5 (м, 6Н, ароматика); 3,6 (т, 1Н, CH-COOH), 3,3 (м, 2H, CH₂NH); 2,2 и 2,3 (2c, 6H, 2CH₃), 1,85-1,6 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 10. Соединение формулы I в виде соли N--метил-L-аргинина (L-NMMA) с индометацином.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств натриевой соли индометацина и N--метил-L-аргинин-ацетата в соответствии со способом, описанным в примере 2 (выход 99%); (желтое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,7-6,35 (м, 7Н, ароматика); 3,67 (2c, 3Н, CH₃O), 3,47 (м, 1H, CH-COOH); 3,35 (c, 2H, CH₂-COOH), 2,97 (м, 2H, CH₂-NH), 2,57 (c, 3H, CH₃NH), 2,05 (2c, 3H, CH₃-C=), 1,72-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 11. Соединение формулы I в виде соли N--нитро-L-аргининметилата (L-NAME) с сулиндаком.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств натриевой соли сулиндака и гидрохлорида N--нитро-L-аргининметилата в соответствии со способом, описанным в примере 2 (выход 98,6%); (оранжевое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,30 (м, 4H, Ph-SO), 6,70 (м, 3Н, Ph-F); 6,11 (м, 1H, =C-H), 3,78 (м, 1H, CH-COOH); 3,62 (c, 3H, OCH₃); 3,18 (широкий с., 2Н, CH₂COOH); 3,00 (м, 2H, CH₂-NH); 2,61 (c, 3H, CH₃-SO), 1,83 (широкий c., 3H, CH₃-C=); 1,90-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 12. Соединение формулы I в виде соли N--метил-L-аргинина (L-NMMA) с мефенамиковой кислотой.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств мефенамиковой кислоты и N--метил-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 3 (выход 99%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 8 (м, 1Н, H ароматич. в орто-положении к COOH); 7,3-6,5 (м, 6Н, Ph); 3,56 (т, 1Н, CH-COOH), 3,2 (м, 2H, CH₂NH); 2,85 (c, 3H, CH₃-NH); 2,2 и 2,3 (2c, 6H, 2CH₃), 1,8-1,6 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 13. Соединение формулы I в виде соли N--нитро-L- аргининa (L-NO) с сулиндаком.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств сулиндака и N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 3 (выход 98%); (оранжевое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,30 (м, 4H, Ph-SO), 6,70 (м, 3Н, Ph-F); 6,11 (м, 1H, = C-H), 3,78 (м, 1H, CH-COOH); 3,18 (широкий с, 2Н, CH₂COOH); 3,00 (м, 2H, CH₂-NH); 2,61 (c, 3H, CH₃-SO), 1,83 (широкий c, 3H, CH₃-C=); 1,90- 1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 14. Соединение формулы I в виде соли метилового эфира-N--нитро-L-аргинина (L-NAME) с салициловой кислотой.

Это соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств натриевой соли салициловой кислоты и гидрохлорида метилового эфира N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 2 (выход 97,8%); (белое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,70-6,68 (м, 4Н, Ph); 4,00 (т, 1Н, CH-COOH); 3,65 (c, 3H, COOCH₃); 3,11 (м, 2H, CH₂-NH); 2,00-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 15. Соединение формулы I в виде соли метилового эфира N--нитро-L-аргинина (L-NAME) с индометацином.

Это соединение получали путем смешивания эквимолярных количеств натриевой соли индометацина и гидрохлорида метилового эфира N--нитро-L-аргинина в соответствии со способом, описанным в примере 2 (выход 98,5%); (желтое твердое вещество, т.пл. >260^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, D₂О): 7,70-6,35 (м, 7Н, ароматика); 3,95 (м, 1H, CH-COOH); 3,67 (широкий c, 6Н, CH₃O, COOCH₃), 3,35 (c, 2H, CH₂-COOH); 3,08 (м, 2H, CH₂-NH); 2,10 (2c, 3H, CH₃-C=), 1,72-1,30 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 16. Соединение формулы I в виде амида ацетилсалициловой кислоты, метилового эфира N--нитро-L-аргинина (L-NAME).

Гидрохлорид метилового эфира N--нитро-L-аргинина (675 мг, 2,5 ммоля) суспендируют в безводном ацетонитриле (15 мл), затем добавляют при перемешивании 0,7 мл (5 ммолей) триэтиламина. Полученный прозрачный раствор охлаждают до 0^oC и затем добавляют ацетилсаликоилхлорид (0,5 г, 2,5 ммоля) в ацетонитриле (8 мл), при этом образуется осадок. Перемешивание продолжают в течение двух часов при комнатной температуре. После этого осадок отфильтровывают, а фильтрат концентрируют досуха. Полученный осадок хроматографируют на колонке с двуокисью кремния (элюент CHCl₃/MeOH=95/5), получая целевое соединение (73%); (белое твердое вещество, т.пл.= 180^oC).

¹H ЯМР (100 МГц, CDCl₃/D₂О): 8,10-6,90 (м, 4Н, Ph); 4,85 (м, 1Н, CH-COOH); 3,82 (c, 3H, OCH₃); 3,40 (м, 2H, CH₂-NH); 2,40 (c, 3H, CH₃-CO), 2,20-1,50 (м, 4H, CH₂-CH₂).

Пример 17. Соединение формулы I в виде амида, сулиндака метилового эфира N--нитро-L-аргинина (L-NAME).

Это соединение получают, используя хлорид сулиндака и метиловый эфир N--нитро-L-аргинина, в соответствии со способом, описанным в примере 16 (выход 70%), (желтое твердое вещество, т.пл.=154-156^oС).

¹H ЯМР (100 МГц, CDCl₃/D₂О): 7,30 (м, 4Н, Ph-SO); 6,70 (м, 3Н, Ph-F); 6,11 (м, 1H, =C-H); 3,60 (c, 3H, OCH₃); 3,15-3,05 (м, 5H, CH₂CON, CHCO₂CH₃, CH₂NH); 2,61 (c, 3H, CH₃-SO), 2,05 (2c, 3H, CH₃-C=), 1,8-1,3 (м, 4H, CH₂ - CH₂).

Пример 18. Соединение формулы I в виде амида ибупрофена метилового эфира N--нитро-L-аргинина (L-NAME).

Это соединение получают, используя бромид ибупрофена и метиловый эфир N--нитро-L-аргинина, в соответствии со способом, описанным в примере 16 (выход 78%), (белое твердое вещество, т.пл.=213^oС).

¹H ЯМР (100 МГц, CDCl₃/D₂О): 7 (м, 4Н, Ph); 3,60 (c, 3H, OCH₃); 3,5-3,3 (м, 2H, CHCON, CHCO₂CH₃); 3,10 (т, 2H, CH₂N); 2,35 (д, 2H, CH₂-Ph), 1,8-1,3 (м, 5H, CH₂-CH₂, CH(CH₃)₂); 1,2 (д, 3H, CH-CH₃), 0,8 (д, 6H, 2CH₃).

Соединения изобретения были испытаны согласно биологическим тестам in vitro и in vivo с целью проверки их активности по блокированию NO-синтазы (конститутивной и индуцибильной) и циклооксигеназы; соединения согласно изобретению показали себя более активными биологически, чем простая смесь двух активных начал. Их активность оценивали также на патологических моделях животных и сравнивали с контрольными соединениями: аспирин, индометацин и L-N^G-моно-метил-аргинин (L-NMMA), а также с простыми смесями этих соединений.

1. Воздействие на конститутивную NO-синтазу выделенной аорты крысы в тесте in vitro
Препараты из выделенной аорты крысы с эндотелием готовят так, как описано в M.Auguet, S.Delaflotte, P.E.Chabrier и P.Braquest - Comparative effects of endothelium and phorbol 12-13 dibutyrate if rat aorta, Life Science, 1989, 45, 2051-2059.

Крыс-самцов породы Sprague Dawley (270-360 г, Charles River, Paris) умерщвляют смещением шейных позвонков, выделяют грудную аорту и очищают от окружающих тканей. Кольца шириной 2 мм суспендируют в ванне с изолированным органом, содержащей 10 мл физиологического раствора (состав его приведен ниже) при натяжении 2 г и температуре 37^oC и насыщают ванну газом O₂/CO₂ (95%/5%). Измеряют эффект сохранения, используя преобразователь смещения под действием силы (Statham UC₂), присоединенный к самописцу Гульда 8000S. Для установления равновесия систему оставляют на один час до проведения измерений. Нормальный физиологический раствор состоит из (ммолей): NaCl 118, KCl 4,7; CaCl₂ 2,5; KH₂PO₄ 1,2; MgSO₄ 0,6; NaHCO₃ 25; глюкозы 11. После установления равновесия в нормальной среде препарат обрабатывают фенилефрином (РЕ, 1 мкМ) максимальной концентрации (около 95%). Когда сокращение становится стабильным, препарат обрабатывают карбахолом (10 мкМ) для определения присутствия или отсутствия эндотелия.

После промывания препарата и периода повторного установления равновесия в течение 45 мин препарат обрабатывают фенилефрином (1 мкМ) и вводят карбахол (10 мкМ) до достижения максимальной релаксации. Затем исследуют антагонисты по методу кумулятивной дозы и рассчитывают IC₅₀ (50%-ную ингибирующую концентрацию) до восстановления релаксации, наведенной карбахолом. Результаты сведены в табл. 1, где во второй колонке приведены результаты теста на конститутивной NО-синтазе.

2. Воздействие на индуцибильную NO-синтазу выделенной аорты крысы в тесте in vitro
Соединения исследовались на выделенной аорте крысы, пораженной шоком, и тестирование проводилось по методу, опубликованному в работе M.Auguet, J.M. Guillon, S. Delaflotte, E.Etiemble, P.E.Chabrier и P.Braquest - Endothelium independent protective effect of N^G-monomethyl-L-Arginige on endotoxin - indused alterations of vascular reactivity, Life Science, 1991, 48, 189-193.

Крысам-самцам породы Sprague Dawley (240-320 г) вводят внутрибрюшинно эндотоксин (10 мг/кг) или растворитель (физиологический раствор, 1 мг/кг). Через три часа у обработанных животных проявляются признаки эндотоксимии, включая пилоэрекцию, диарею и летаргию. Крыс умерщвляют путем смещения шейных позвонков, выделяют грудную аорту и очищают ее от окружающих тканей. Кольца шириной 2 мм суспендируют при натяжении 2 н в ванночках с органом, содержащих 10 мл раствора Кребса- Хенселейта (мМ): NaCl 118, KCl 4,7; CaCl₂ 2,5; KH₂PO₄ 1,2; MgSO₄ 0,6; NaHCO₃ 25; глюкоза 11. Через раствор постоянно пропускают газ O₂/CO₂ (95%/5%). Эндотелий удаляют механически осторожными движениями небольшого пинцета с внутренней поверхности колец. После периода установления равновесия в течение 90 мин вызывают сокращение введением фенилфрина (РЕ, 1 мкМ) максимальной концентрации. По завершении этой стадии проводят проверку карбохолом (10 мкМ), чтобы проверить наличие эндотелия (11). За 45 мин до введения РЕ в ванночку вводят антагонисты и определяют IC₅₀. Результаты сведены в табл. 1, третья колонка, озаглавленная "Тест на индуцибильной NO-синтазе".

3. Воздействие на индуцибильную NO-синтазу обработанных липополисахаридами (LPS) гладкомышечных клеток сосудов в тесте in vitro
Некоторые соединения исследовались на гладкомышечных клетках в культурах, где NO-синтазу индуцируют при помощи LPS (M.Auguet, M.O.Lonchampt, S. Delaflotte, P.E.Chabrier и P.Braquet - FEBS Letters, 1992).

Гладкомышечные клетки выделяют ферментацией (эластаза и коллагеназа) из грудной аорты крысы, как описано в документе (P.E.Chabrier, P.Roubert, M.O. Lonchampt, P. Plas и P.Braquet - J.Biol.Chem., 1988, 263, 13199-13202). Их культуры культивируют 4 дня в DMEM, содержащей 10% телячьей плодной сыворотки, и используют между 3 и 7 пассажами. Монослои клеток промывают и заменяют среду на 2 мл DMEM, содержащей 2 мМ глутамина, антибиотики, 0,1 мМ изобутилксантина (1ВМХ), с или без LPS (Escherichia Coli). Через 24 часа из клеток экстрагируют с GMP путем быстрого отсасывания среды и добавки по 1 мл 0,1 N HCl в каждую лунку. Образцы замораживают до определения cGMP радиоиммунологическим способом (устройство NEN). Для изучения ингибирующего действия клетки инкубируют в течение 24 ч в RPM1 1640 (концентрация L-аргинина составляет 1,2 мМ) с или без LPS (0,1 /мл). За 30 мин до экстракции cGMP добавляют IBMX (0,1 мМ) в присутствии или в отсутствии исследуемого соединения (10^-4 М). Измеряют снижение производства cGMP (% снижения). Полученные результаты сведены в табл.2.

4. Воздействие на агрегацию промытых тромбоцитов кролика, вызванную арахидоновой кислотой в тесте in vitro
Этот тест осуществляют для определения воздействия соединений согласно изобретению на циклооксигеназу. Измерение агрегации тромбоцитов проводят в соответствии с Cazenave и др. (Ann.Biol.Chem. 1983, 41, 167-179). Кровь берут из ушной артерии самца Новозеландского кролика (средний вес тела 2,5 кг) на ACD (лимонная кислота/цитрат натрия/декстроза) в качестве антикоагулянта. Подготовленные промытые тромбоциты переносят в кювету агрегометра (Chronolog aggregometer Coultronics). Добавляют антагонисты и арахидоновую кислоту (0,5 мМ) и измеряют процент трансмиссии, соответствующий агрегации (или ее ингибированию), для определения IC₅₀. Результаты приведены в табл. 3. HA - означает - "не активен".

5. Воздействие на производство нитрита, вызываемое липополисахаридами и гамма-интерфероном на клеточные линии I774 A₁ моноцитов/макрофагов in vitro
Клетки макрофагов типа клеточной линии J774 A₁ интересны с точки зрения их использования, так как они являются важными клетками в воспалительных процессах и выделяют большое количество NO (вследствие индуцирования NO-синтазы) и продуктов циклооксигеназы. Клетки активируют липополисахаридами (LPS) в присутствии гамма-интерферона (INF). Этот опыт проводят для сравнения эффекта соединений согласно изобретению с эффектом смеси отдельно взятых родственных соединений.

Клетки моноцитов/макрофагов крысы выращивают при 37^oC в среде Игла, модифицированной по способу Дульбукко. Клетки размещают в 24-х лунках пластины для культивирования (NUNC) и используют для экспериментов около 210^-5 клеток/пластину. Клетки активируют с помощью LPS (1 г/мл) из E.Coli (S055: B5) и крысиного рекомбинантного гамма-интерферона (50 Ед/мл), а затем инкубируют в присутствии или в отсутствии исследуемых соединений.

Через 48 ч определяют в культуральной среде уровень нитрита (NO₂-), который коррелируют с активированием NO- синтазы, определение проводят колориметрическим способом по методу Грина и др. (см. L.Green, D.Wagner, J.Glogowski, P.Skipper, J.Wishwok и S.Tannenbaum. Анализ нитрата, нитрита и [15N] нитрата в биологических жидкостях. Аналитическая Биохимия 126, 131-138, 1982).

Производство NO₂- не определяется в присутствии или в отсутствии соединений, если клетки неактивированы. В В активированных клетках значения IC₅₀ для соединений L-NMMA, L-NO и L-NAME составляют 810^-6 M, 1,510^-5 M и 10^-3 М, соответственно, тогда как такие ингибиторы циклооксигеназы, как салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота, индометацин, меклофенамат, фактически неактивны, т.е. с небольшим ингибированием 0,5-15%.

Для иллюстрации значительно большей активности соединений - ассоциатов по сравнению со смесями отдельных соединений приведены некоторые примеры в табл. 4. Там представлен процент ингибирования производства нитрита, под действием LPS+INF на клеточные линии J774.

Результаты показывают, что соединения согласно изобретению являются более активными при эквивалентных концентрациях, чем смеси отдельных исходных соединений, из которых их получают. Это указывает также на более сильный эффект двойных ингибиторов NO-синтазы и циклооксигеназы.

6. Влияние на производство простагландина, индуцируемое LPS +IFN на клеточной линии J774AA1 моноцитов/макрофагов in vitro
В эксперименте, аналогичном описанному выше, сравнивают воздействие соединения согласно изобретению с воздействием смесей на производство продуктов циклооксигеназы для того, чтобы проверить увеличение активности соединений согласно изобретению также и в отношении ингибирования циклооксигеназы.

Уровень одного из основных продуктов циклооксигеназы, производимого на клеточной линии J774 A1 (т.е. 6 кето - PGF₁ ) стабильного метаболита PGI₂ определяют в культуральной среде специфическим радиоиммунологическим способом (NEN,KIT NEK 025). Во-первых, обнаружено, что выделение 6 кето-PGE₁ в культуральной среде не зависит от соединения L-NMMA, L-NAME или L-NO, но уменьшается под действием индометацина и аспирина, завися от дозы, со средними значениями IC₅₀ 10^-6 и 10^-5 М. Процент ингибирования производства 6-кето-PGFI, индуцированного LPS+INF на клеточной линии J774A1, представлен в табл. 5, которая показывает, что соединения согласно изобретению имеют большую активность, чем смеси индивидуальных соединений.

7. Влияние на производство нитрита из активированных мышиных макрофагов in vitro
Для подтверждения результатов, полученных на клеточной линии J774 и показывающих значительно большую активность синтезированных соединений по сравнению со смесью ингибитора циклооксигеназы и ингибитора NO-синтазы, аналогичные эксперименты проводили на активированных мышиных макрофагах.

Перитональные макрофаги получают из брюшиной полости самок ВВА/2 мыши 7-8 недельного возраста через 3 дня после инъекции тиогликолята (3% 1,5 мл/мышь). Макрофаги (210₅ клеток/лунку) активируют при 37^oC с помощью LPS (E. Coli 0111B4) (0,1 мкг/мл) и мышиного рекомбинантного гамма-интерферона (100 Ед/мл) в лунках микропластины из 96 лунок в течение 20 ч на RPM1 1640, 10% FBS, затем промывают и инкубируют в течение 24 ч. Клетки инкубируют в отсутствии и в присутствии различных соединений и измеряют уровень нитрита в среде культуры, как уже было описано.

Результаты в процентах, полученных в различных опытах, по сравнению с контролем показывают, что они изменяются: 56% для ассоциата индометацина с L-NMMA (пример 10), 32% для смеси индометацина и L-NMMA и менее 30% для каждого отдельного соединения.

Кроме того, уровень нитрита составляет 48% ассоциата индометацина с L-NAME (пример 15), 25% для индометацина и менее 15% для L-NAME и его смесей.

8. Влияние на летальность, индуцируемую NMDA (N-метил-D- аспартатом) in vitro
Глутамат и аспартат являются важными нейровозбуждающими медиаторами, которые задействованы при церебральной ишемии. Их влияние осуществляется исключительно через активацию NMDA рецептора. Внутривенные инъекции большой дозы NMDA вызывает смерть менее чем через 35 с. Соединения, способные отодвинуть время летального исхода, считают в этом тесте потенциальными антиишемическими соединениями. Так как влияние аспартата или глутамата может зависеть от увеличения выделения NO, заявители используют этот тест для определения активности соединений и для сравнения эффектов in vivo ассоциатов смесей и отдельных соединений.

Самцу мыши OF1 (20-22 г, Charles Rives) делают инъекцию 250 мг/кг NMDA (внутривенно) через 1 ч после орального приема вещества. Измеряют время жизни. Таким образом, ассоциаты согласно изобретению значительно более активны, чем отдельные соединения, применяемые по одному или в смеси. Ассоциаты демонстрируют также синергический эффект (см. табл.6).

9. Влияние на гибель нейронов после локальной церебральной ишемии у мышей в тесте in vivo
Через 5 ч после возникновения кортикального инфаркта, индуцированного закупоркой средней церебральной артерии у самцов мыши (порода Swiss) (20-22 г) согласно методу Давиджера и др. (Pharmacology of cerebral ischemia in Krieglstein and Oberpichler, Wissenschaftleche Verlagsgesellschaft, Штутгарт, 1990, 409-413) систематически интраперитонально (и.п.) вводят исследуемые соединения. Через 4 дня мышь обезглавливают и выделяют мозг, замораживают его и разрезают на тонкие слои толщиной 10 мкм. Измеряют область инфаркта путем визуального анализа. Измеряют уменьшение инфарктной области и сравнивают с необработанными животными. Результаты, выраженные в процентах, указывают величину уменьшения инфаркта, определенную для группы из 6 животных МК 801, в качестве контрольного вещества используют антагонист NMDA. Полученные результаты приведены в табл. 7.

10. Тест in vivo воздействия на крыс, обработанных эндотоксином с проколом спинного мозга
Как сообщалось выше, ассоциаты ингибитора NO-синтазы и ингибитора циклооксигеназы оказывают синергический эффект, восстанавливая кровяное давление и реактивность сосудов у зараженных животных и животных, обработанных эндотоксином. Самцам крысы Sprague Dawley (вес тела 280-320 г) делают укол в спинной мозг. Через час после этого животным вводят эндотоксин (EDTX, Escherichia Coli, липополисахарид, 0111, В₄=300 мгк/кг/ч) в течение 60 мин. Это приводит к значительной гипотонии и потере реактивности сосудов в отношении сосудосуживающих агентов, таких, как метоксамин. Через 60 мин после перфузии соединений с эндотоксином получают кривую зависимости "доза-эффект" при метоксамине и определяют значение DЕ₅₀ (50%-ная эффективная доза для восстановления нормальной активности в отношении метоксамина) методом регрессивного анализа для каждого животного. Полученные результаты приведены в табл. 8.

Токсикология: соединения вводят пероральным путем (п.о.) или интраперитональным путем (и.п.) группам мышей из 10 животных с увеличением дозы. LD₅₀ (летальная доза 50%) для животных составляет величину от 100 до 1000 (п.о.) и от 150 до 500 (и.п.).

Дозировка: соединения согласно изобретению можно принимать в дозах от 1 до 300 мг в день.

Соединения согласно изобретению могут быть использованы в виде следующих фармкомпозиций:
а) Рецептура в виде таблеток для орального введения:
Активный ингредиент примера 1 - 10 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: маннит, малеиновая кислота, поливидон, бикарбонат натрия, в количестве, достаточном до 2 г
б) Рецептура в виде таблеток для орального введения:
Активный ингредиент примера 5 - 50 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: бикарбонат натрия, лимонная кислота, лактоза, аспартам, в количестве, достаточном до 2 г
в) Рецептура в виде таблеток для орального введения:
Активный ингредиент примера 9 - 150 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: крахмал, стеарат магния, целлюлоза, в количестве, достаточном до 2 г
г) Рецептура в виде таблеток для орального введения:
Активный ингредиент примера 14 - 250 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: крахмал, поливидон, тальк, в количестве, достаточном до 2 г
д) Водный раствор для внутримышечных инъекций:
Активный ингредиент примера 6 - 10 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: хлорид натрия, вода для инъекций, в достаточном количестве до 5 мл
е) Водный раствор для внутримышечных инъекций:
Активный ингредиент примера 11 - 50 мг
Соответствующие вспомогательные вещества: сахароза, водно- спиртовой раствор для инъекций, в достаточном количестве до 5 мл.

Формула изобретения

1. Двойные ингибиторы NO-синтазы и циклооксигеназы общей формулы I

где А группа формулы
или группа формулы
где R радикал ингибитора циклооксигеназы, выбранный из салицилатов, фенаматов, производных бензолуксусной кислоты, или радикал индометацина или сулиндака;
R₁ атом водорода, метил, этил;
R₂ атом водорода, нитрогруппа;
R₃ амино- или метиламиногруппа,
при условии, что если А группа
R₂ атом водорода, то R₃ не является аминогруппой.

2. Соединения по п.1, в которых ингибитор циклооксигеназы общей формулы RCOOH выбирают из салициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты, мефенамовой кислоты, ибупрофена, индометацина и сулиндака.

3. Соединения по п.1, в которых А группа формулы

где R имеет вышеуказанные значения.

4. Соединения по п.1, в которых А группа формулы

где R имеет указанные значения.

5. Способ получения двойных ингибиторов NO-синтазы и циклооксигеназы формулы I по п.1, отличающийся тем, что соединение формулы II
RCOOH,
где R имеет указанные значения,
или его соль или соединение формулы III
RCOX,
где Х атом галогена,
подвергают взаимодействию с соединением формулы IV

где R₁, R₂, R₃ имеют указанные значения,
или его солью в эквимолярном количестве.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют в воде или смеси воды и спирта при температуре от комнатной до температуры кипения реакционной массы.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют в ацетонитриле при температуре от 0^o до комнатной в присутствии основания.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая двойной ингибирующей активностью NO-синтазы и циклооксигеназы, содержащая активное начало и фармацевтически приемлемые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного начала она содержит соединение общей формулы I по пп.1 4 в эффективном количестве.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3