Способ биодеградации ипритсодержащих смесей, штамм бактерий pseudomonas species 8-2 - биодеградатор иприта, штамм бактерий pseudomonas doudorofii 70-11 - биодеградатор иприта и штамм бактерий corynebacterium species кзб - биодеградатор иприта

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: предлагается способ биодеградации иприта, заключающийся в последовательной обработке ипритсодержащих смесей сначала микроорганизмами, разрушающими связь C-Cl, а затем бактериями, конвертирующими тиодигликоль в органические кислоты; одновременно предложены штаммы микроорганизмов Pseudomonas species шт. 8-2, Pseudomonas doudorofii шт. 70-11, Corynebacterium species шт. КЗБ, обладающие способностью к биодеградации иприта. 4 с. и 6 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к прикладной микробиологии, а именно к способам микробиологической переработки химических препаратов, в частности химического оружия.

В настоящее время микроорганизмы достаточно широко используются для очистки почвы и воды от веществ, загрязняющих окружающую среду, в частности нефти и нефтепродуктов, нитратов, фосфорорганических веществ (ФОВ), например пестицидов и т.д. [1]. Однако в каждом конкретном случае необходим скрининг микроорганизмов, способных осуществлять необходимую деструкцию токсичных структур.

Среди способов биодеградации химических отравляющих веществ (ХОВ) наибольшее число работ посвящено уничтожению ФОВ типа VX. Для гидролиза C-P связи в подобных соединениях используются микроорганизмы ряда Pseudomonas [2, 3].

Наименее изучаемыми являются процессы биодеградации иприта бис(2-хлорэтил)сульфида, который способен до 50 лет после попадания в почву сохранять поражающие свойства [4] , хотя вещество и способно гидролизоваться на ипритхлоргидрин и тиодигликоль или на 1,2бис(2хлорэтилтио)этан, 1,2-дихлорэтан и 1,4-дитиан, а также высокомолекулярные аддукты [1, 4, 5].

Известно, что для разложения иприта в водных растворах могут быть использованы штаммы Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas putida, выделенные из донного ила Мексиканского залива и утилизирующие тиодигликоль [6]. Однако данные штаммы применяются только после гидролиза иприта.

Прототипом заявляемой группы изобретений является способ, заключающийся в использовании для деградации микроорганизмов рода Pseudomonas (гетеротрофы) или Tiobacillus (хемотрофы), полученных методом накопительных культур и разлагающих иприт на метан, углекислый газ, хлориды и сульфаты [7] .

Подробная информация об использованных микроорганизмах в литературе, доступной для неопределенного круга лиц, отсутствует.

Задачей, решаемой авторами, являлось: поиск режима обработки иприта и подбор штаммов, позволяющих утилизировать негидролизованный иприт, а также позволяющих на его основе получать вещества, представляющие коммерческий интерес.

Задача решается последовательной обработкой ипритсодержащей массы сначала микроорганизмами, разрушающими связи C-Cl, а затем микроорганизмами, конвертирующими тиодигликоль (ТДГ) в гликолевые кислоты, в частности 2-оксиэтилтиогликолевую и/или тиодигликолевую.

Деструкцию связи C-Cl осуществляли с использованием микроорганизмов Pseudomonas doudoroffii шт. 70-11, Pseudomonas sp. шт 8-1, 8-2, 8-3; Corynebacterium sp. КЗБ или их ассоциатов, т.е. взятых в виде индивидуальных культур или их смесей в соотношении 1:1-1:2.

Лучшие результаты достигались при проведении деструкции при 20-30^oС (лучше 28^oС) на среде (pH 7.5-7.6), содержащей до 3,0 г/л иприта или его гидролизата и 7-40 г/л добавок неорганических солей в воде, например, (г/л): 3.0-5.0 (NH₄)₂SO₄, 1.0-2.0 K₂HPO₄, 1.0-2.0 KH₂PO₄, 0.1-0.3 MgSO₄, 0.01-30.0 NaCl.

Окисление ТДГ осуществляли с использованием в качестве микроорганизмов Gluconobacter oxydans или Pseudomonas sp. 8-2. При этом Ps.sp. шт. 8-2 и Gluconobacter oxydans вводили в качестве добавки в смесь, образовавшуюся в ходе деструкции, или раствор ТДГ в количестве 3-5 г/л при pH 6.5-7.5. Микроорганизмы вводят в дозе 10⁹-10¹⁰ кл/мл.

Преимуществом способа является более высокая скорость разложения по сравнению с химическим гидролизом, полная деградация ОВ, утилизация продуктов дехлорирования.

Наиболее эффективным является использование для биодеградации иприта штаммов Pseudomonas species шт. 8-2, Pseudomonas doudorofii шт. 70-11, Corynebacterium species шт. КЗБ.

Штамм 8-2 Pseudomonas sp. был выделен из почвы г. С.-Петербурга, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-602".

Штамм растет на СПА или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0, глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; K₂HPO₄ 1.5; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄7H₂O 0.2; агар-агар 20.0, вода остальное; при pH 7.0, температуре 28^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

Клетки представляют собой на твердой среде палочки длиной 0.85-3.26 мкм и шириной 0.43-0.59 мкм. Спор не образует. Клетки подвижны, имеют жгутики на одном из полюсов. Микроорганизмы относятся к грамотрицательным.

Штамм хорошо растет на среде с аммонийным азотом, образует кислоту при росте на среде с глюкозой, галактозой, маннозой, ксилозой. Не образует кислоту на среде с сахарозой, лактозой, арабинозой, рамнозой, маннитом, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Культура не образует индола и сероводорода, имеет положительный аэробный тест Хью-Лейфсона, каталозо- и оксидазоположительна, уреазоотрицательна, не обладает -галактозидазной активностью. Желатину, крахмал и казеин не гидролизует. Дезаминирует фенилаланин. Способностью к денитрификации не обладает.

Штамм, как показали проведенные эксперименты, является деструктором хлорорганических соединений, в частности иприта.

Штамм Corynebacterium sp. КЗБ был выделен из почвы С.-Петербурга, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-604".

Штамм растет на СПА или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0; глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; K₂HPO₄ 1.5; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄7H₂O 0.2; агар-агар 20.0. pH 7.0. Температура 28^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

На твердой среде клетки представляют собой палочки со средними размерами 0.75x2.3 мкм. Спор не образует, клетки неподвижны, жгутиков не имеют, грамположительны.

Штамм растет на среде с аммонийным и нитратным азотом, не использует органические источники азота. Образует кислоту при росте на среде с глюкозой, маннозой, сахарозой, маннитом, не образует кислоту на среде с галактозой, ксилозой, арабинозой, рамнозой, лактозой, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Культура не образует индола и сероводорода. Имеет положительный аэробный и анаэробный тест Хью-Лейфсона, обладает -галактозидазной активностью, каталозо-положительна. Желатину, крахмал, казеин не гидролизует, фенилаланин не дезаминирует, восстанавливает нитраты.

Штамм является деструктором хлорорганических соединений, в том числе иприта.

Штамм Pseudomonas doudoroffii шт. 70-11 был выделен из морской воды Балтийского моря, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-603".

Культура хорошо растет на СПА с 3% NaCl или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0; глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄7H₂O 0.2; K₂HPO₄ 1.5 NaCl 30.0; агар-агар 20.0. pH 7.0, температура 20^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

На твердой среде клетки представляют собой палочки со средними размерами 0.5x1.3 мкм. Спор не образуют. Клетки подвижны, жгутикование - монополярный политрих. Грамотрицательны.

Культура растет на среде с аммонийным и нитратным азотом, гидролизует мочевину. Образует кислоту при росте на среде с глюкозой, маннозой, ксилозой, арабинозой, сахарозой и маннитом. Не образует кислоту на среде с лактозой, рамнозой, мальтозой, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Не образует индола и сероводорода. Культура имеет положительный аэробный тест Хью-Лейфсона, каталозо- и оксидазо-положительна, -галактозидазной активностью не обладает. Желатину, крахмал, казеин не гидролизует. Не дезаминирует фенилаланин. Восстанавливает нитраты.

Штамм является деструктором хлорорганических соединений, в том числе иприта.

Сущность изобретения и его практическая применимость иллюстрируется примерами.

Пример 1. 80 г иприта гидролизовали в 1000 мл воды при pH 11 в течение 4 ч. Полученный гидролизат, содержащий 0,56% хлорорганических веществ распада иприта (ХОС) и 7,2% тиодигликоля, добавляли в питательную среду (исходя из 40% от ее объема), содержащую микроорганизмы Pseudomonas sp. 8-1 и шт. 8-2 в соотношении 1:2 исходя из 10¹⁰ клеток/мл. Полученная среда содержала (г/л), тиодигликоль 28,8; ХОС 2,8; (NH₄)₂SO₄ 5,0; K₂HPO₄ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,3. Вода остальное.

Смесь выдерживали в течение 9 сут при 28^oC и скорости перемешивания 180 об/мин. Период полураспада ХОС 2.2 сут, скорость дехлорирования 311 мг/сут. Степень утилизации органических веществ - 10,5%. Степень деградации ХОС 100%.

После завершения процесса в среду дополнительно вводили культуру Pseudomonas sp. 8-2 в дозе 0.410⁹ кл/мл и выдерживали в течение 6 сут при 28^oC.

Степень деградации тиодигликоля 96%.

Пример 2. В условиях примера 1 в среду, содержащую в 1 л; 12,9 г тиогликоля, 1,0 г хлорорганических веществ, 1,5 г K₂HPO₄, 4,0 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г MgSO₄7H₂O; KH₂PO₄ 1,5 г, 0,01 г NaCl вводили 310⁹ кл/мл смеси в соотношении 1:1 Pseudomonas sp. 8-2 и 8-3, pH среды 7.5.

Смесь выдерживали 6 сут при 28^oC на роторной качалке при 230 об/мин.

Время полураспада составило 1.2 сут. Скорость дехлорирования 167 мг/сут. Прирост баомассы 180%, степень утилизации субстрата 52,8%.

Через 6 сут в среду добавляли культуру, содержащую 210¹⁰ кл/мл Gluconobacter oxydans, выращенную на среде, содержащей в 1 л 3,0 г сорбита, 0,3 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г дрожжевого автолизата, при pH 6.5 в течение 25 ч.

Степень конверсии тиодигликоля 100%.

Пример 3. В условиях примера 1 на среде, содержащей в 1 л воды 5,2 г ТДГ, 0,4 г ХОС, 3,0 г (NH₄)₂SO₄, 1,0 г K₂HPO₂, 2,0 г KH₂PO₄, 0,1 г MgSO₄ и смесь, содержащую смесь 1:1 микроорганизмов Pseudomonas sp. 8-2 и Corynebacterium sp. шт. КЗБ в общей дозе 10¹¹ кл/мл. Смесь выдерживали 5 сут при 28^oC и перемешивали (200 об/мин).

Время полураспада 0,9 сут. Скорость дехлорирования 80 мг/сут, степень утилизации субстрата 98%.

Пример 4. В условиях примера 3 при соотношении Pseudomonas sp. 8-2 и Corynebacterium sp. соответственно 2:1 и 1:2 при времени полураспада соответственно 0,8 и 0,9 сут скорости дехлорирования составили 92 мл/сут и 80 мг/сут.

Пример 5. В условиях примера 2 были проведены опыты при использовании вместо ассоциата индивидуальных штаммов Pseudomonas sp. шт. 8-2, Corynebacterium sp. шт. КЗБ и Ps. doudoroffii шт. 70-11 (последнюю культивировали при 20^oC и введении в среду 20-30 г/л NaCl).

Время полураспада составляло соответственно 1,3, 1,5, 6,1 сут.

Скорости дехлорирования 157, 149 и 51 мг/сут соответственно.

Пример 6. Культуру Gluconobacter oxydans, выращенную на среде, содержащей (г/л): 3,0 г сорбита, 2,5 г автолизата дрожжей, 0,3 г (NH₄)₂SO₄ в течение 20 ч, в дозе 3 г/л вводили в растворы, содержащие 2,0% CaCO₃ и от 0,2 до 10,0% ТДГ.

Время полной конверсии составило при 0,2% ТДГ 3 сут., 2% ТДГ 9 ч, 5% ТДГ 24 ч, 10% ТДГ 42 ч. Полученная смесь содержала 2-оксиэтитиоглюколевую и тиодигликолевую кислоты.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Харечко А.Т. и др. Российский химический журнал, 1998, т. 37, N 3, с. 40-43.

2. Attaway H. , Nelson J.O. e.a. Appl. & Environ. Microbiol., 1987, v. 53, N 7, p. 1375-1382.

3. Kaaijk J., Frijlink C., Pestic. Sci., 1977, v. 8, N 4, p. 544-548.

4. Pensci E. C., TR-ARCSL-TR-83021.AD B07518L Aberdeen Proving Grouns, MD:US Army, Res.Devel.Command, 1983.

5. Small M.J., TR-8208 (AD-B077 091) Fort Detrick, MD:US Army Med.Res. Devel.Command., 1983.

6. Биологическая дегазация отравляющих веществ. Материалы конференции НИИ НАТО. Май 1991. М., 1991.

7. Арбисман Я.С. и др. Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Минск, 1998, т. 4, с. 8-9.2

Формула изобретения

1. Способ биодеградации ипритсодержащих смесей путем обработки их воздействием микроорганизмов при их культивировании на ипритсодержащих средах, отличающийся тем, что обработку смесей осуществляют последовательно микроорганизмами, вызывающими деструкцию связи углерод хлор, а затем микроорганизмами, утилизирующими тиодигликоль.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для деструкции связи углерод - хлор используют штамм бактерий Pseudomonas doudorofii 70-11 ВНИИСХМ Д-603, штамм бактерий Pseudomonas species 8-1, штамм бактерий Pseudomonas species 8-2 ВНИИСХМ Д-602, штамм бактерий Pseudomonas species 8-3, штамм бактерий Corynebacterium species КЗБ ВНИИСХМ Д-604 или их ассоцианты.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что обработку осуществляют при культивировании микроорганизмов при 20 30^oС на среде, содержащей до 3 г/л иприта или его гидролизатов и 7 40 г/л минеральных солей при pН 7,5 - 7,6.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве минеральных солей используют смесь, содержащую (NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, NaCl при следующем соотношении компонентов, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3 5 K₂HPO₄ 1 2 KH₂PO₄ 1 2 MgSO₄ 0,1 0,3 NaCl 0,01 30,0 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для утилизации тиодигликоля смесь обрабатывают штаммом бактерий Pseudomonas species 8-2.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для утилизации тиодигликоля смесь обрабатывают микроорганизмом Gluconobacter oxydans.

7. Способ по любому из пп.1 6, отличающийся тем, что микроорганизмы вводят в дозе 10⁹ 10¹¹ кл/мл.

8. Штамм бактерий Pseudomonas species 8-2 ВНИИСХМ Д-602 биодеградатор иприта.

9. Штамм бактерий Pseudomonas doudorofii 70-11 ВНИИСХМ Д-603 - биодеградатор иприта.

10. Штамм бактерий Corynebacterium species КЗБ ВНИИСХМ Д-604 - биодеградатор иприта.