Патент ссср 217687

Взамен ранее изданного

2I7687

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СвВз Соеетскит

Социзлистичзскиз

Республиз

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 05.1.1967 (№ 1124465/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 07.Ч.1968. Бюллетень № 16

Дата опубликования описания 15.XII.1969

Кл. 42L, 5/02

Комитет со целан

МПК 6 Oln

УДК 637.127.6 (088.8) изобретений и открытий ори Совете Министров

СССР

Автор изобретения

Заявитель

Э. Е. Грудзинская

Всесоюзный научно-исследовательский институт молочной промышленности

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ

В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Известны способы определения свободных аминокислот в молоке и молочных продуктах путем осаждения из пробы исследуемого продукта белков молока абсолютным спиртом, удаления осажденных белков одним .из известных способов, например центрифугированием, извлечения из пробы балластных веществ и хроматографирования, предусматривающего многократную разгонку свободных аминокислот на хроматографической бумаге системой растворителя, состоящей из и-бутанола, ледяной уксу.спой кислоты и дистиллированной воды, а также сушку хроматограммы после каждого раза разгонки и проявление пятен аминокислот раствором нингидрина в ацетоне. Очистку пробы от балластных веществ ведут с помощью ионообменной смолы, а разгонку пятен берут каждый раз до конца листа хроматографической бумаги.

Для более точного определения свободных аминокислот, а также упрощения его предложено пробу исследуемого продукта брать в количестве 200 мл, извлечение балластных веществ из пробы осуществлять подкисленным концентрированной соляной кислотой абсолютным спиртом, соотношение компонентов в системе растворителей (и-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная лода) подбирать соответственно 4: 1: 1, разгонку аминокислот вести вначале до /з листа

2 хроматографической бумаги, затем до /2, /4 и два раза до конца листа, сушить хроматограмму при комнатной температуре (18 — 20 С) .

5 Для предотвращения потерь аминокислот в процессе подготовки пробы исследуемого продукта к хроматографированию следует фильтрат, полученный после удаления белков из пробы исследуемого продукта, и элюат, полу10 ченный после удаления балластных веществ, упаривать в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45 — 55 С и давлении О,б ати, а концентрат аминокислот, полученный после упаривания элюата, растворять в 3 мл

15 10% -ного изопропилового спирта.

Чтобы более четко выявлять проявленные пятна аминокислот, целесообразно хроматограмму после сушки выдерживать 20 мин при б5 С.

Способ заключается в следующем, Берут пробу молока в количестве 200 мм, к пробе добавляют 400 мл этанола, выдерживают не менее 2 час при температуре — 3, — 4 С, за25 тем удаляют белки путем отфильтрования нли центрифугирования. Прозрачный фильтрат упаривают при О,б атм и температуре 45—

55" С в вакуумсушильном шкафу. В случае наличия большого количества липидов и пигЗр ментов фильтрат обрабатывают хлороформом.

217687

Предмет изобретения

Составитель М. И. Адреева

Редактор В. Ф. Чулкова Техред Л. Я. Левина Корректор Г. С, Мухина

Заказ 3250/5 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва 5К-35, Раушская наб., д. 4l5

Типография, пр. Сапунова, 2

Сгущенный остаток, полученный после сушки, содержит кроме аминокислот балластные вещества, которые осаждают подкисленным с помощью концентрированной соляной кислоты этиловым спиртом (на 100 мл абсолютного этанола 0,5 мл концентрированной НС1).

Отфильтровывают балластные вещества и упаривают (при том же режиме сушки) элюат аминокислот.

Аминокислоты (сухой остаток) растворяют в 3 мл 10а/р-ного изопропилового спирта. Образцы наносят на хроматографическую бумагу, подсушивают, после чего помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей и-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная вода в:соотношении 4:1: l.

Для разгонки пятен систему растворителей пропускают через лист хроматографической бумаги, причем делают это ступенчато по следующей схеме: на /з, /2, /4 листа и два раза до конца хроматограммы. После каждой .разгонки хроматограмму сушат при температуре помещения, Окончив пятикратный прогон растворителей, хроматограмму проявляют 0,5>/о-ным нингидрином в ацетоне с добавкой ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 95: 1: 4. После сушки проявленной хроматограммы ее выдерживают 20 мин при

65 С.

Этим способом четко разделяются до 15 следующих аминокислот: цистеин + цистин, лизин, гистидин, аргинин, серии, глицин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, треонин, алании, тирозин, валин, метионин, фенилаланин, лейцин+ изолейцин. Интенсивность окраски пятен зависит от количественного содержания той или иной аминокислоты.

1. Способ определения свободных аминокислот в молоке и молочных продуктах, заключающийся в осаждении из пробы исследуемого продукта белков молока абсолютным спир5

4 том, удалении осажденных белков одним из известных способов, например центрифугированием, упариванием фильтрата, извлечении из пробы балластных веществ .и хроматографировании, предусматривающем многократ:ную разгонку свободных аминокислот на хроматографической бумаге системой растворителя, состоящей из н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды, а также сушку хроматограммы после каждого раза разгонки и проявление пятен аминокислот на хроматограмме раствором нингидрина в ацетоне с добавлением ледяной уксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью более точного определения свободных аминокислот, а также упрощения способа, пробу исследуемого продукта берут;в количестве

200 мл, извлечение балластных веществ из пробы осуществляют подкисленным концентрированной соляной кислотой абсолютным спиртом, соотношение компонентов в системе растворителей (к-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная вода) под. .бирают соответственно 4: 1: 1, причем разгон. ку аминокислот ведут вначале до /з листа хроматографической бумаги, затем до /2, после чего до /4 листа .и два раза до конца листа, при этом сушку ведут при температуре от

18 до 20 С.

2. Способ,по п. 1, отличающийся тем, что, с целью предотвращения потерь аминокислот в процессе, подготовки пробы исследуемого продукта к хроматографированию, фильтрат, полученный после удаления белков из пробы исследуемого продукта,,и элюат, полученный после удаления балластных веществ из пробы продукта, упаривают при температуре, равной 45 — 55 С, и давлении, равном 0,6 ати, а концентрат аминокислот, полученный после упаривания элюата,,растворяют в 3 мл 10>/оного изопропилового спирта.

3, Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью более четкого выявления проявленных пятен свободных аминокислот, хроматограмму после сушки выдерживают 20 мин при

65 С.