Штамм бактерий тнеrмus тнеrморнilus - продуцент днк- полимеразы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ku0g@gf

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНфй,,„,," ;

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4745580/13 (22) 31 08.89 (46) 30.1293 Бюл. На 48 — 47 (71) Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики;

Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа; Научно — производственный кооператив "Аква культура" (72) Крамаров B.М„. Глухов А.И.; Киселев В.И.; Кисе— лев О.И.; Северин ЕС. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ THERMUS

THERM0PHlLUS — ПРОДУЦЕНТ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ (57) Использование: микробиология, биохимия и биотехнология, в частности изучение высокоочиI U. ных препаратов ферментов. Сущногть изобре) те я: штамм Thermus thermophilus ВКПМ В-4892, выращивают в среде, содержащей мас%: дрожже) вой экстракт 0,2%; триптон 0,3%; глюкоза 0,3%; NaCI

1 (19) SU (11) 18391S9 Л1 (51) 0,5. За 5 — 6 ч культивирования при 72 С с 20 л среды получают 55 — 60 г биомассы. В результате хроматографической очистки ДНК-полимеразы осуществляют последовательно на ДЭАЭ-целлюлозе, фосфоцеллюлозы, гидрокилаппатите достигают удельную активность 35000 ед/мг. Фермент сохраняет свою активность в течение 1,5 ч при

92" С и в течение 1 ч при 95 С. Штамм Thermus

thermophilus ВКПМ В4892 выделен из горячих вод

Камчатки (Долина Гейзеров) и обладает следующими биотехнологичеаами характеристиками: способностью продуцировать ДНК-полимеразу с оптимальной температурой функционирования свыше 75 С и отсутствием в штамме рестриктаз. В связи с этим данный штамм-продуцент можно использовать как источник термостабильной ДНК-полимеразы, которую можно эффективно использо— вать в реакции циклической амплификации при

ДНК-диагностике различных заболеваний. 3 табл.

1839189

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных препаратов ферментов, Известен штамм Thermus thermophiius

НВ8 — продуцент термостабильной ДНКполимеразы (1).

Недостатком данного штамма является то, что помимо ДН К-полимераэы

Т thermophilus НВ8 содержит рестриктазу

TthHB81 (2), которая в процессе очистки соочищается с ДН К-полимеразой, так, что и репараты ДНК-полимеразы после 3 — 4 хроматографических стадий очистки содержат примеси рестриктазы Tth HBB 1. Так как субстратом ДН К-полимеразы и рестриктазы является ДНК, то присутствие в препарате рестриктазы может привести к деградации субстрата и искажению результатов ДНКполимераэной реакции, Дальнейшая очистка препарата ДН К-полимеразы от

20 рестриктазы ведет к увеличению числа хроматографических стадий, уменьшению выхода целевого продукта и его удельной активности.

Вторым существенным недостатком из- 25 вестного штамма является то. что оптимальные условия функционирования

ДНК-полимераэы не превышают 63 С, тогда как при использовании фермента в реакции циклической амплификации 30 генетического материала требуется фермент с оптимальной температурой функционирования в области 75 — 80 С.

Таким образом, использование известного штамма Thermus therrnophilus НВ8 не позволяет получить препарат ДН К-полимеразы с высоким выходом, свободный от нуклеаз и обладающий способностью нормально функционировать в диапазоне

75-80 С. 40

Наиболее близким к предложенному является штамм бактерий Thermus spesies

ВКПМ В-4896, продуцирующий термостабильную ДНК-полимеразу íà CL питательной среде. После отделения клеток из 5-6 ч 45 культуры получают 50 r клеток. Удельная активность сырого экстракта составляет 12 ед/мг белка, общая активность 48 10 ед.

После очистки фермента хроматографией на фосфоцеллюлозе и аффинной хроматог- 50 рафии на ДНК-целлюлозе и гидроксилапатите получают ДНК-полимеразу с удельной, активностью 25000 ед/мг белка, общей активностью 27000 ед (2).

Целью изобретения является получение штамма-продуцента, не содержащего рестриктазы и содержащего ДНК-полимераэу с оптимальной температурой функционирования свыше 75 С.

Поставленная цель достигается использованием в качестве продуцента ДНК-полимераэы штамма Thermus thermophiius

КТП, Используемый штамм ТлпегпзорЫ!цэ

КТП выделен из горячих вод Камчатки (До-. лина Гейзеров). Штамм обладает следующими признаками. Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, толщиной 0,5-0,8 мкм, длиной 5 — 10 мкм, Образуют нити длиной от 20 до 200 мкм, неподвижные, эндоспор нет, грамотрицательные. Культуральные признаки; хорошо растут на простых питательных средах с содержанием дрожжевого экстракта и пептона не выше 1 г/л, При росте на агаре колонии круглые, край ровный, прижаты, имеют желто-коричневый пигмент. При росте в жидких средах образуют ровную интенсивную муть, в невстряхиваемых жидких культурах образуется поверхностная пленка. Физиолого-биохимические признаки: температурный оптимум 70 — 90 С, оптимум рН 6,7 — 7,9, Облигатные аэробы. Хороший рост на средах с триптоном 0,1-0,3% и дрожжевым экстрактом 0,1 — 0,3%. Плохой рост на средах с содержанием триптона и дрожжевого экстракта свыше 1%. Рост на среде с гидролизатом казеина (0,1%), свободным от витаминов, и с добавлением глутаминовой кислоты (0,5%) в качестве источников углерода, азота и энергии. Растет на синтетической среде с сульфатом аммония или глутаматом, используемыми в качестве источников азота, и с углеводами или солями органических кислот — глюкозой или сахарозой, ацетатом, сукцинатом, цитратом, нет роста на среде с нитратами, используемыми в качестве источников азота.

Чувствительна к антибиотикам — ампицилину, тетрациклину, канамицину, Пример 1. 1.Штамм Thermus

thermophiius КТП, являющийся продуцентом термостабильной ДНК-полимераэы, выращивают в среде, содержащей, мас,%: дрожжевой экстракт 0,2; триптон 0.3; глюкозу 0,3; NaCI 0,5. За 5 — 6 ч культивирования при температуре 72 С с 20 л среды получают

55 — 60 r биомассы.

2,Хроматографическая очистка термостабильной ДНК-полимеразы из штамма

Thermus thermophilus КТП.

2,1.Начальная плотность засева культуры 0,1-0,2 ед/мл, по поглощению среды при

Asso. Температура инкубации 73 +2 С. Выращивание культуры ведут до плотности 3 ед/мл. После центрифугирования с 10 л среды получают 30 r биомассы. К 30 г биомассы добавляют равный обьем буфера, содержащего 10 мм трис-HCI, p W 7,8 и далее биомассу разрушают на ультразвуковом

1839189 езинтеграторе с амплитудой 18 мк в тече, ие 30 мин с 30 с паузами, охлаждая льдом. атем гомогенат центрифугируют для осажения дебриса при 100000g 1,5 ч. В суперннатанте определяют активность

НК-полимераэы, которая составляет 45 д/мг белка.

2.2.Супернатант после центрифугироания наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлоой (V» = 50 мл). Элюцию проводят ,инейным градиентом (400х400 мл) 0,01— ,25 M NaCI в 10 мм трис-HCI, рН 7,8. Собиают фракцию, выходящую при 0,15 М NaCI. змеряют активность ДНК-полимераэы. алее белковую фракцию наносят на колону с фосфо-целлюлозной (Н» = 37,5 мл), уравовешенную КФ буфером (10 мм гН Р04-КНгРОа рН 7,0, 1 мм ЭДТА), Провоят элюцию градиентом (200х200/мл) 0,1— ,6 М NaCI на КФ.

Собирают фракцию, выходящую при ,33 М NaCI, измеряют активность ДНК-полмеразы. Далее фракцию наносят на колону с ГАПом (гидроксилаппатит) (V» = 9,6 мл), равновешенную КФ, и проводят элюцию радиентом(50х50 мл) 0,02 — 0,2 M КФ. Собиают фракцию, выходящую при 0,33 M NaCI, змеряют активность ДН К-полимеразы. Даее фракцию наносят на колонку с ГАПом (идроксилаппатит) (V» = 9,6 мл), уравновеенную КФ, и проводят элюцию градиен. (50х50 мл) 0,02 — 0,2 М КФ, Собирают :цию, выходящую при 0,15 M КФ, Иэмеяют активность ДНК-полимеразы. Далее ракцию диализуют в течение ночи при темературе+4 С против буфера, содержащего

0 мм КФ рН 7,0, 100 мм NaCI, 0,5 мм ЭДТА, мм ДТТ, 50 глицерол. Измеряют активость фермента, которая практически не изеняется по сравнению с активностью осле очистки на ГАПе.

Стадии очистки и значения активности

НК-полимеразы суммированы в табл.1.

3.Изучение термостабильности ДНКолимеразы из Thermus thermophilus КТП.

Фермент прогревали в течение различого времени при температурах 92 и 95 С и измеряли его активность. Результаты приведены в табл.2.

Как видно иэ табл,2, фермент сохраняет свою активность в течение 1,5 ч при 92 С и в течение 1 ч при 95 С, что позволяет более эффективно использовать его в методе ПЦР.

Пример 2. Проверка температурного оптимума функционирования ДНК полимеразы из Thermus thermophllus КТП.

10 10 г биомассы Thermus thermophllus

КТП суспендируют в буфере. содержащем

25 мМ NaCI, 25 мМ трис-HCI, рН 7; 9,2 мМ

2-меркаптоэтанол, 0,001 M ЭДТА, клетки разрушают ультразвуком при охлаждении

15 льдом, клеточные стенки осаждают центрифугированием при 16000g, Из надосадочной жидкости ДНК-полимеразу очищают хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе. фосфоцеллюлозе, оксиапатите. Тестирование фермента во фуакциях проводят по включению деэокси (H)g ТТФ в ДНК, "активированную" ультразвуком, в реакционной смеси (20 мкл), содержащей 0,25 о.е. ДНК, 1 мкм деэоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пико25 моль (H)g ТТФ, 25 мМ Трис-HCI рН 8.3, 10 мМ М9С!г, 5 мМ ДТТ и фермент. После завершения реакции кислотонерастворимый продукт переносят на фильтры, радиоактивность подсчитывают в сцинтилляционном

30 счетчике.

Результаты эксперимента изложены в табл.3.

Данные эксперимента показывают, что оптимум температуры функционирования

35 ДНК-полимераэы лежит выше 70 С, Таким образом, как показано, предлагаемый штамм Thermus thermophilus КТП не содержит рестриктазы, что облегчает выделение и очистку ДНК-полимеразы.

40 (56) 1. Е ur. l, В i ochem. — 1985, ч,149, N. 1, р.4146.

2,FEBS Lett. — 1980, ч.109, М 1, р.156563.

45 З.Авторское свидетельство СССР

N. 1830944, кл. С 12 N 9/12. 1989.

1839189

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Формула изобретения

Штамм бактерий fhermus thermophilus

ВКПМ В-4892 - продуцент ДНК-полимеразы.

Составитель И. Привалова

Техред М.Моргентал Корректор Л. Филь

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Редактор

Заказ 3404

Производственно-издагельский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101