Способ определения вируса табачной мозаики

 

Использование: в сельском хозяйстве и в MMMyHo6nofexh orHH для диагностики растительных вирусов. Сущность изобретения: антитела связывают с носителем - плоскими полиамидными мембранами при помощи 2,0-3,0%-ного раствора глутарового диальдегида или 0,4-1,2%-ного раствора госсипола, добавляют вирус табачной мозаики и антитела, меченные фосфолипазой АЗ. В качестве субстрата используют яичный лецитин , регистрируют продукты ферментативной реакции потенциометрически. Способ позволяет повысить чувствительность анализа и многократно использовать носитель с иммобилизованными антителами . 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4867991/14 (22) 21.09,91 (46) 23.05,93. Бюл,М 19 (71) Ташкентский государственный университет им.В.И.Ленина, Институт микробиологии АН УССР (72) А.З.Заитова, A.Х,Вахабов, P.Aõìåäæàнов и M.М,Рахимов (56) J.Gen.Virot, 1977, у 34, N 2, р,475-483. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ (57) Использование: в сельском хозяйстве и в иммунобио1ехнологии для диагностики

Изобретение относится к иммунобиотехнологии, именно к способам диагностики растительных вирусов, и может быть использовано в сельском хозяйстве для выявления заболеваний растений и в научных исследованиях.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа и воэможности многократного использования носителя. *

Цель достигается тем, что в известном способе определения вируса табачной мозаики (ВТМ) путем нанесения антител на носитель, промывания, добавления ВТМ, коньюгированных с ферментом антител и субстрата с последующей регистрацией продуктов ферментативной реакции, в качестве носителя используют полиамидные плоские мембраны, обработанные 2-3%ным раствором глутарового диальдегида (ГА) или 0,4 — 1,2%-ным раствором госсипола, в качестве фермента используют фосфолипаэу А2, в качестве субстрата — яичный лецитин,,, Я2„„1817025 А1 растительных вирусов. Сущность изобретения: антитела связывают с носителем — плоскими полиамидными мембранами при помощи 2,0-3,0%-ного раствора глутарового диальдегида или 0,4 — 1,2%-ного раствора госсипола, добавляют вирус табачной мозаики и антитела, меченные фосфолипазой А2.

В качестве субстрата используют яичный лецитин, регистрируют продукты ферментативной реакции потенциометрически, Способ позволяет повысить чувствительность анализа и многократно использовать носитель с иммобилизованными антителами, 2 табл.

Существенные отличия заключаются в том, что в предлагаемом способе достигается ковалентное связывание антител с поверхностью активированной полиамидной микропористой мембраны с последующей адсорбционной иммобилиэацией вируса, а затем конъюгата тех же антител и фермента за счет специфических иммунных связей и определения количества связанного вируса по продуктам ферментативной реакции, Предлагаемое решение способствует обеспечению многократности использования носителя с иммобилизованными антитетелами и повышению чувствительности.

Пример 1. Полиамидную мембрану весом 9,6 мг заливают 1 мл 2,5 н.раствора соляной кислоты и инкубируют в течение 2 ч при температуре 45 С и перемешивания для активации поверхности носителя за счет ограниченного кислотного гидролиза. Избыток кислоты удаляют промыванием дистиллированной водой и 0,1 М боратным буфером, рН 9,0. К активированной поли1817025

Мембраны с иммубилизованными антителами хранят в 0,1 M боратном буфере рН 9,0 или в высушенном состоянии в полиэтиленовых мешочках при температуре около 40С. 3

Перед использованием для ИФА мембрану трижды промывают 0,05 М трис-Hci буфером с рН 7,5, содержащего 0,05 Твин э-20.

Для осуществления ИФА к мембране с иммобилизованными антителами приливают 0,5 мл 0,05 М трис-НС(буфера, рН 7,5, содержащего 30 ммоль хлористого кальция и 50 этиленгликоля (сорбирующий буфер) и

0,5 мл исследуемого на вирус образца, После инкубации 1 ч при 37 С мембрану промывают от несвязанного вируса и приливают 1 мл сорбирующего буфера, содержащего 5 — 10 мкг (по белку) конъюгата антител с фосфолипазой Аг и оставляют на

1 ч при 37 С и непрерывно перемешивают.

Мембрану многократно отмывают от несвязанного конъюгатэ 0,05 М трис-HCI буфером с рН 7,5, содержащем 0,17,-ный тритон Х100 для полного удаления неспецифически связанных белков.

Определение фосфолипазной активности проводят методом потенциометрического титрования при постоянном значении рН, испольэ,в титрометрическую установку

1000 = мкмоль ЖК мин . г амидной мембране добавляют 1 мл того же буфера, содержащего 0,1 мл 2,5 -ного раствора ГА и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре для модификации функциональных групп носителя. Избыток

ГА удаляют промыванием носителя 10-кратным количеством 0,05 М боратного буфера, рН 9,0. К модифицированному полиамиду приливают 1 мл 0,1 М бвратного буфера с рН 9,0, содержащего 35 мкг (по белку) антител, очищенных методом аффинной хроматографии из сыворотки кроликов, иммунизированных томатным штаммом вируса табачной мозаики. Инкубация идет в течение 48 ч при 4 С и непрерывном перемешивании. Несвязавшиеся антитела удаляют промыванием мембраны 0,05 М боратным буфером, рН 9,0 до исчезновения следов белка. К мембране с ковалентно иммобилизованными антителами добавляют 1 мл 0,1 M боратного буфера рН 9,0, содержащего глицина (из расчета 0,35 г на 1 г носителя) и инкубируют в течение 2 ч для блокирования альдегидных групп, оставшихся после присоединения антител. Избыток глицина удаляют промыванием мембраны 5-кратным (по объему) количеством 0,05 М боратного буфера, рН 9,0 (4-5 раз); рН-стат Т вЂ” 108, состоящую из блока автоматического титрования (БАТ), блока сопряже-. ния (БС), электродной части, соединенной с рН-метром, Для поддержания постоянной

5 температуры используют водный ультратер- мостат,УТ вЂ” 15 с термостатированной отводной ячейкой, которую помещают на магнитную мешалку.

Реакционную смесь наливают в

10 стеклянный стаканчик объемом 15 — 20 мл мешают в ячейку, Общий объем суб стратной смеси составляет 10 мл и содержит: 140 ммоль NaCI, 10ммоль СаС!г, 6 ммоль тритона Х-100, 0,5 ммоль трис-HCI

15 буфера с рН 8,5, 2,2 ммоль яичного лецитина, рН среды 8,5, температура 38 С.

В смесь опускают электроды и капилляр для подачи титрующего раствора с помощью автобюретки, включает титратор и, 20 доводя рН и температуру смеси до заданной точки, производят контрольное титрование субстрата в течение 5 мин. После этого в ячейку опускают мембрану — (массой 9 — 10 мг) после проведения ИФА и снова в тече25 ние 5 мин оттитровывают образующиеся кислотные продукты реакции. Титрующий раствор — 0,02 н,йаОН. Регистрацию изменения кислотности среды проводят на самописце во время или по показанию счетчика

30 дозатора, Титрование выделившихся свободных жирных кислот проводится автоматически при постоянном значении рН.

Активность фосфолипазы Az конъюгата

5 на мембране по скорости гидролиза субстрата выражают в микромолях жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 г полиамидэ и вычисляют по формуле

Vo — конечный объем щелочи, мл (израсходованной на тировэние продуктов реакции ферментов на мембране);

V — начальный объем щелочи, мл (израс50 ходованный на титрование субстрата);

N — нормальность раствора щелочи в микромолях;

t — время, мин; и — масса навески мембраны, мг.

55 Для определения активности исходной фосфолипазы А или ее коньюгэтэ с антителами в реакционную смесь добавляют 0,05—

0,2 мкг (по белку) фермента или 0,5 — 2,0 мкг конь ю гата.

1817025

Удельная активность фермента или коньюгатэ выражают в мкмолях свободных жирных кислот, за 1 мин в расчете на 1 мг белка.

Чувствительность при определении ак- 5 тивности фосфолипазы А2 титрометрическим методом составляет 0,02 мкг (по белку) фермента или 1 ммоль/мин по продуктам реакции. Ошибка метода 5, В данном примере на поверхности мем- 10 браны связалось 24,6 мкг (по белку) антител.

При проведении ИФА на этой мембране в модельных опытах с чистым препаратом

ТШ вЂ” ВТМ в количестве 3,0 нанограмм (нг) в пробе скорость реакции коньюгата, связан- 15 ного с вирусом, составляет 85,25 ммоль/мин на 1 г носителя, После ИФА мембрану регенерируют путем промывания 0,05 M трис-NaOH буфером, рН 10,5 — 11,0 с добавлением 1 М KCI и 20

0,015 М ЭДТА для удаления коньюгата и вируса с поверхности носителя с иммобилизованными антителаMè и после промывки вторично используют для ИФА ТШ вЂ” BTM, Результат после повторного использо- 25 . вания аналогичен данным первичного анализа. После 3-кратного пользования воспроизводимость результатов анализа составляет 98/, кратного 4-кратного 95%, 5-кратного 93, 6-кратного 90/. 30

Пример 2. Анализ осуществляют аналогично примеру 1. Для кавэлентнаго связывания антител с поверхностью носителя применяют 2,0/-ный раствор глутароeoio альдегида. 35

Результаты анализа: на поверхности мембраны связалась 23,0 мкг (no белку) антител, скорость реакции при ИФА ТШ—

BTM — 80,3 мкмоль/мин на 1 г носителя, Пример 3. Анализ осуществляют 40 аналогично примеру 1, Для ковалентного присоединения антител к носителю используют 3,0О/о ГА

Результаты анализа: на мембрану иммобилизовалось 22,8 мкг (по белку) антител, 45 скорость реакции при ИФА ТШ-BTM — 78,1 мкмоль/мин.

Как видно из приведенных примеров, 2,5 -ный раствор ГА является оптимальным для иммобилизации антител на поли- 50 амидную мембрану.

При увеличении концентрации ГА в инкубационной среде наблюдается уменьшение количества иммобилизованных антител и соответственно занижение результатов 55

ИФА, При уменьшении концентрации ГА в среде наблюдается такая же картина.

Возможно, при использовании 2,5 ного раствора ГА на поверхности мембраны образуются цепи длиной, отвечающей наиболее равномерному образованию пространственных структуру, что обеспечивает оптимальные условия для проведения ИФА вируса табачной мозаики.

Пример 4. Анализ осуществляют аналогично примеру 1. Для ковалентного связывания антител с поверхностью мембраны используют 0,8 -ный раствор госсипола.

Результаты анализа: на мембрану иммобилизовалось 24,6 мкг (по белку) антител, скорость реакции при ИФА ТШ-ВТМ (3,0 нг) — 85,0 мкмоль/мин.

Пример 5. Анализ осуществляют аналогично примеру 1. Для ковалентного связывания антител с поверхностью мембраны используют 0,4о -ный раствор госсипола, Результаты анализа: на мембрану связалось 15,3 мкг (по белку) антител, скорость реакции и ри ИФА ТШ вЂ” BTM — 48,5 мкмоль/мин.

Пример 6. Анализ осуществляют аналогично примеру 1. Для ковалентного связывания антител к поверхности мембраны используют 1,2 -ный раствор госсипола.

Результаты анализа; на мембрану иммобилизовалось 24,5 мкг (по белку) антител, скорость реакции при ИФА ТШ вЂ” ВТМ вЂ” 85,0 мкмол ь/мин, В табл.1 представлены результаты исследования по определению зависимости скорости ферментативной реакции при

ИФА от массы мембраны и количества антител, иммобилизованных на ней.

В целях экономии антител и носителя целесообразно испольэовать для иммобилизации антитела в количестве 15 — 35 мкг на

9 — 10 мг носителя. Мембраны массой 3,3 мг можно использовать только для ИФА разбавленных растворов при содержании ТШ—

ВТМ от 0,003-3,0 нг в определяемой пробе.

При идентификации вируса выше этих количеств в пробе наблюдались искажения резул ьтдто В.

В табл,2 представлены результаты, из которых видно, что чувствительность составляет 0,003-0,030 нг BTM в пробе.

Данные приведенные втабл,2 получены без применения тритона Х-100 для промывочных операций. Использование 0,1-0,5%ного тритона Х-100 для промывки мембран снижает фон в 2 — 3 раза, Кроме того следует отметить, чта имеющийся фон ниже по сравнению с адсорбционной иммабилизацией, Предлагаемый способ имеет следующее преимущества по сравнению с прототипом: увеличивается чувствительно

1817025

Таблица 1

Влияние массы мембраны и количества антител на скорость ферментативной реакции

П р и м е ч а н и е. При проведении ИФА на мембране, содержание ТШ-BTM в пробе 3,0 нг. (0,003 нг — 0,030 нг BTM в пробе против 1,0 нг) и повышается точность анализа, возрастает кратность использования носителя, а также расширяются возможности методов идентификации продуктов ферментивной реакции;

Формула изобретения

Способ определения вируса табачной мозаики (ВТМ), включающий нанесение антител на носитель, промывание, добавление

ВТМ, конъюгированных с ферментом антител и субстрата, с последующей регистрацией продуктов ферментативной реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и

5 возможности многократного использования носителя, в качестве носителя используют полиамидные плоские мембраны, образованные 2 — 37;-ным раствором глутарового диальдегида или 0,4 — 1,2 -ный рас10 твором госсипола и антителами, в качестве фермента используют фосфолипазу А, а в качестве субстрата — яичный лецитин, 10

1817025

Таблица 2

Данные ИФА с чистым препаратом вируса табачной мозаики

П р и м е ч а н и е. Количество иммобилизованных антител на мембрану массой 9,0 мг15 мкг.

Составитель А,Заитова

Техред М.Моргентал Корректор С.Лисина

Редактор T.Èâàíîâà

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 1720 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5