Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител

 

Использование: в медицине, в частности в технике проведения иммунологических реакций. Сущность изобретения: получают клеточную взвесь из чистой популяции иммунекомпетентных клеток, наносят ее на предметное стекло, инкубируют при комнатной температуре, прикрепляют клетки к предметному стеклу с последующим ингибированием активности эндогенной пероксидазы клеток раствором перекиси водорода и проведением иммунофермёнтной реакции. При этом прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течении 10 мин в 100%-ном растворе ацетона, с охлажденном до 0-(+5)°С. Способ прост в исполнении и не требует импортных реактивов. 1 з.п. ф-лы. 3 табл. С

СОКГ, Соиi 1C.KMX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РГСПУВПИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4871261/14 (22) 20.08,90 (46) 07.05;93. Бюл. М 17 (71) Туркменский научно-исследовательский институт онкологии и Туркменский научно-исследовательский институт профилактической и клинической медицины (72) Х,П.Кадыров и Я.Пирлеков (56) Mehta М.М. et а! Immunofluorescence

with monoclonal antifodies an poli-1=ИсНпе

caated slides:àn atternatiwe то сопнем!опа!

methods. 8lut. 1983.-v,47.-%5.-рр.237. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТА

ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬН IX

АНТИТЕЛ

Изобретение относится к технике проведения иммунологических реакций и может быть использовано при иммунодиагностике лейкозов и для определения субпопуляции лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител (МКА), Цель изобретения — повышение эффективности и качества исследований за счет ликвидации дефицита времени при иммунофенотипировании клеток с МКА. возможность систематизации большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества пациентов непосредственно в месте vox проживания с последующим проведением исследований в лабораторных условиях, при этом снижается стоимость исследователь„„5U„„1814074 А1 (51)л G 01 N 33/53 (57) Использование: в медицине, в частности в технике проведения иммунологических реакций, Сущность изобретения; получают клеточную взвесь из чистой популяции иммунокомпетентных клеток, наносят ее на предметное стекло, инкубируют при комнатной температуре, прикрепляют клетки к предметному стеклу с последующим ингибированием активности эндогенной пероксидазы клеток раствором перекиси водорода и проведением иммуноферментной реакции, При этом прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течении 10 мин в 100; -ном растворе ацетона,охлажденном до 0-(+5) С. Способ прост в исполнении и не требует импортных реактивов.

1 з, и. ф-л ы. 3 табл. ских работ за счет исключения из методики поли-L-n из и на, Поставленная цель достигается тем, что в способе подготовки препаратов для микроскопических исследований иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител, включающий взятие пробы у донора, выделение чистой популяции иммунокомпетентных клеток, прикрепление клеток к предметному стеклу, ингибирование активность эндогенной пероксидазы клеток и нанесение на клетки моноклональных антител, отмывка последних и нанесение вторичных антител меченой пероксидазой, ее отмывка, проявление резуль1атов реакции с помощью раствора 3 -З-диаминобензидина, ( модифицируется этап прикрепление клеток к предметному стеклу,t.å. в место ранее применяемого для этой цг ли поли-(-лизина

1814074

25

40 заменяют фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до 0...+5"С 100%-ном ацетоне, По мнению автора операция фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до О...+5 С 100%-ном растворе ацетона придают способу новые свойства; удлиняет срок сохранности препарата,что позволяет расширить масштабы применения способа во времени, в пространстве (брать пробы у большого количества людей на периферии, а обрабатывать препараты и систематизировать исследования — B цент)>альной лаборатории), Способ осуществляется следующим образом, После выделения чистой популяции иммунокомпетентных клеток (лимфоциты, клетки костного мозга) иэ них готовится клеточный взвесь, так чтобы в 1 мл среды 199 содержали 8 — 10 млн клеток, Затем по 50 мкл клеточной взвеси вносится в каждую парафильную лунку предметного стекла. После этого предметное стекло с клетками инкубируется при комнатной температуре на 20 мин для осаждения клеток к стеклу. Надосадочную жидкость отсасывают и предметное стекло помещают в стакан, содержащий

100%-ный раствор ацетона, охлажденный до О...+5 С. Клетки в ацетоне фиксируются в холодильнике в течение 10 мин. После этого клетки высушиваются в воздухе, и таким способом фиксированные клетки можно хранить длительное BpeMR (6 — 8 суток) или >ке сразу начать исследования. Но прежде чем начать исследование, проводят регидратацию с помощью инкубирования клеток в среде 199 на 10 мин при комнатной температуре, Такой препарат испытан авторами иммуноферментном методом для определения иммунологического подварианта острого лимфобластного лейкоза и для субтипирования лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, Исследование проводили с использованием отечественных моноклональных антител серии ИКО, предоставлены д.м.н. Барышниковым Л,IO. и приобретены у кооператива "БИОЛАМ" ВОНЦ AMH СССР, г, Москва. Ниже приводятся специфичность использованных в работе МКА, 50

Пример 1, У здорового донора М, (порядковый М 1 в таблице 2) из локтевой вены была взята кровь для определения субпопуляции лимфоцитов. Цельную кровь разводили 1;3 средой 199, наслаивали на градиент фиколл-верографина (9 обьемов крови за 3 обьема градиента) и центрифугировали при 170 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали из интерфазы пастеровской пипеткой. Клетки трижды отмывали средой 199 с помощью центрифугирования. Затем в каждую лунку 2 предметных стекол вносили по

50 мкл 1 х 10 /мл исследуемых клеток. Клет6 ки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, среду отсасывали и предметные стекла помещали в охлажденном растворе ацетона при 5"С на 10 мин в холодильник.

С одним из препаратов сразу начали проводить исследование, второй хранили в холо.дильнике в течение недели, Первый препарат отмывали в среде 199 за 10 мин, Ингибировали эндогенной пероксидазой клеток с помощью 3%-"ного раствора Н202 в течение 10 мин, Затем на препарате проводили иммуноферментную реакцию llo следующей схеме: на клетки наносили MKA на

30 мин, вторичная антисыворотка против иммуноглобулинов мыши, меченая пероксидаэой, 30 минут. Все этапы инкубации осуществляли во влажной камере при комнатной температуре. После каждого из них клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не давая. клеткам высохнуть, наносили следующие реактивы. После всех-этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-диаминобензидина.

Раствор диаминобенэидина готовили "ех

tempore" (0,5 мг мл с добавлением 2 мкл

33%-ной перекиси водорода), Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемую НИИ эпидемиологии и микробиологии им; Н,cD,Ãàìàëåè, г, Москва, использовали в разведении 1:20. Оценка полученных результатов показала, что уданного донора ИКР-1+ клетки составляют 22% от общего числа клеток в препарате, ИКО-87

72%, ИКО-31 21%, ИКО-86 46%, ИКО-12

28%, MKO 88%. Полученные данные с помощью нашего способа согласуется с данными других авторов, которые. получили с применением поли-L-лизина. Аналогичные параллельные исследования с применением поли-L-лизина у данного же донора показали тот же результат. Через .8 дней повторяли исследование с препаратом, хранившимся в холодильнике, и получали идентичный результат, Признаков разрушения клеток и неспецифического окрашивания не наблюдали. В препарате с поли-L-лизином по истечении 8 дней наблюдались прорось в препарате. большинство клеток было разрушено, некоторые разрушились частично, видны только "обломки" клеток. Наблюдается неспецифическое окрашивание клеток в виде диффузной сорбции антител веществами разрушенных клеток. Для убедительности полученных данных те же исследования были проведены у 10 здоровых nn«opoa. Peли- =лизина.

55 эультаты этих исследований представлены в табл. 2.

KBK видно иэ табл. 2, принципиальных расхождений в результатах по обеим методикам не наблюдалось.

Пример2, У больной А (табл. 3) цитологически подтвержден н ы и диагноз — острый лимфобластный лейкоз. Проводили определение иммунологического подварианта заболевания с применением МКА. Костно-мозговый пунктат поместили в среду

199, содержащую раствор гепарина (50 ед/мл). Содержащиеся в нем эритроциты лизировйли с помощью гипотонического раствора, Отмывали клетки в среде 199 три раза..Затем в каждую лунку 2 предметных стекол вносили по 50 мкл 1 х 10 /мл исследуемых клеток. Клетки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, Среды отсасывали, предметные стекла помещали в охлажденный раствор ацетон при 0 С. С одним из препаратов сразу начинали проводить исследование, второй хранили в холодильнике 6 суток, Проводили регидрирование клеток с помощью инкубации препарата в среде 199 за 10 мин. Ин гибировали активность эндогенной пероксидазы клеток в растворе Н202 в течение 10 мин. Затем проводили иммуно ферментную реакцию по следующей схеме; на клетки наносили МКА на 30 минут, затем вторичную ангисыворотку против иммуноглобулиноа мышей, меченные пероксидаэой — 30 мин, Все э апы инкубации осуществляли so влажной камере при комнатной температуре. После каждой инкубации клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не давая клеткам высохнуть, наносили следующие реактивы.

После проведения всех этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-диаминобензидина. Раствор диаминобензидина готовили "ех реп роге" (0,5 мгl мл с добавлением 2 мкл 33%-ного Н О ), Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемой НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, г,Москва, использовали в разведении 1:20. Оценка полученных результатов показала, что доминирующие количества бластных клеток экспрессируют Тклеточные антигены, На основании этих данных был поставлен диагноз Т-клеточный зариант острого лимфобластного лейкоза.

Аналогичные параллельные исследования с применением поли-L-лизина показали тот же результат, Через 6 дней повторно исследовали препарат, хранившийся в холодильнике., и получили идентичный результат.

Признаков разрушения клеток, неспецифического окрашивания или каких-нибудь ар5

35 тефактов не наблюдали. В препарате с поли-L-лизином по истечении 6 дней наблюдалась пророст, большинство клеток было разрушено, некоторые час-,ично разрушились, видны "обломки" клеток. Наблюдается также неспецифическое окрашивание препарата в виде диффузионной сорбции антител веществами разрушенных клеток. Для убедительности полученных данных параллельные исследования были проведены у 12 бальных с острыми лимфобластными лейкозами. Результаты данного исследования представлены в табл. 3, Как видно из данных табл. 3, принципиальных расхождений в результатах, полученных с применением обеих методик, не наблюдалось.

Предлагаемый способ имеет ряд преимуществ перед способом с применением поли- -лизина, Главные иэ них — общедоступность раствора ацетона, в противоположность дорогостоящей импортной поли-L-лизина. Кроме того, описанный способ сокращает рабочее время, препараты, подготовленные этим способом можно хранить 6-8 дней в холодильнике и ставить иммунологические реакции одновременно большим количеством случаев, спланировать работы на перспективу, набрать материал непосредственно на местах проживания больных и проводить исследования в лабораторных условиях, возможность применения исследования при профилактических осмотрах, переставлять реакции на одном и том же случаях с возможностью возвращения описания результатов исследования, что невозможно при использовании способа с применением поФормула изобоетения

1. Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител путем получения клеточной взвеси из чистой популяции иммунокомпетентных клеток, нанесения ее на предметное стекло, инкубации при комнатной температуре, прикрепления клеток к предметному стеклу, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течение 10 мин в 100%-ном растворе ацето-. на, охлажденном до температуры 0-50С.

2, Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и и ся тем, что регидратацию клеток осуществляют путем их инкубирования в среде 199 в течение 10 мин при комнатной температуре, 1814074

Таблица 1

Специфичность моноклональных антител

Таблица2

Результаты параллельного проведения субтипирования лимфоцитов здоровых доноров с помощью моноклональных антител предлагаемым способом и с применением поли-L-лизина

И КО-87

И КО-12

И КО-86

И КО-31

И КО-59

ИКО-1 оно ы

20/21

19/20

21/20

25/23

23/22

24/21.

21/25

24/23

20/22

22/23. 71/71

70/69

73/72

72/73

69/70

75/74

66/64

70/73, 71/71

60/66

21/22

20/21

22/.21

21/20

25/24

20/19

28/26

30/29

28/27

21/23

П р и м е ч а н и е: в числителе-%-ное содержание антиген положительных клеток при фиксировании в охлажденном ацетоне, в знаменателе-%-ное содержание антиген положительных клеток при применении поли-L-лизина, Таблиц ° 3

Результаты параллельного проееденил имиунофенотипмроезнил клеток костного нозга у больнык с острыи лимфоблзстныы леакозоы с оомощью ионоклональнык антител предлагаемым способом и с применением поли4:лизина

Им нологический по еа знт ззболеаанмл

ИКО-12 ИКО 35

ИКО 31 ИКО-86

I4K 1М-1

Больные ИКО-1

NK0-87

B/8 38/39

21/22

22/23

38/37 37/36

63/64

32/33

58/59

56/57

23/24

23/22!

l р и ы е ч а н н е: а числителе-т,-ное содеризние антиген полоиительнык ваток прм биксмроеаним е оклало!лимом ацетоне. е знзыензтеле-ф-нее содериание згпитен полоиительнык клеток прм прмиененим полич:лизина.

2

4

В

78 9

11. 12.1

3

5

7

9

80/78

88/85

92/93

8!/83

3/3

7/7

3/3 !

Э/13 .

8/8

6/6

18/1&

13/13

33/30 зело

30/23

30/31

О/О

2/2

3/2

3/3

О/О

О/О

О/О

48/49

58/57

50/49

2/2

3/3 .

5/5

В/6

4/4

3/3

7/7

8/8

3/3

7/7

2/2

11/11

78/73

83 83

3/3

8/8

7/7

6/6

9/9

10/10

4/4

8/В

3-3

2/2

О/О7/7

94/93

85/86

72/70.

83/81

В/б

9/9

3/3

6/В

1О/1О

17/18

11/12

2/2

3/3

18/20

11/11 . °

Э/3

5/5

45/46

44/46

43/42 .

46/45

43/42

45/46

46/45

43/44

47/45

45/43

27/28

30/31

28/23

25/24

30/31

27/26

32/35

30/31

33/34

22/23

Т-клеточный ОЛЛ

Т-клеточный ОЛЛ

Т-клеточный ОЛЛ

Т-клеточный ОЛЛ

В-клеточный ОЛЛ

Ъ-клеточный ОЛЛ

Общий ОЛЛ

Общий ОЛЛ

"Общий ОЛЛ

"Общий ОЛЛ

Нулееой ОЛЛ леаой ОЛЛ

89/88

98/93 . 95/96

97/95

93/96

95/94

96/95

98/95

92/93

99/96