Способ определения фентанила в водных растворах

 

Использование: в иммунологии, в частности относится к иммунохимическому анализу , и может быть использовано для определения фентанила. Сущность изобретения: для иммуноферментного определе; ния фенталина кроличьи антитела к коныогату бычьего сывороточного альбумина и карбоксифентанила, полученному в реакции смешанных ангидридов и имеющему эпитопную плотность 12, взаимодействующие с твердофазнымтест-антигеном, в качестве которого используют с коньюгат гамма-глобулина лошади с карбоксифентанилом, полученный в реакции смешанных ангидридов и имеющий эпитопную плотность 29. Способ позволяет проводить определение фентанила с чувствительностью 2,5-10 ммоля в пробе. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з 6 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (I 0CllATEHT CCCP) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4898136/14 (22) 02.01-91 (46) 30.04.93. Бюл. гв 16 (71) Государственный союзный научно-исследовательский институт органйческой химии и технологии

P2) В.Г.Зорян, А.А.Буркин, Т.А.Медведева, С.В.Царева, Ю.M.Êîñûðåâ, В.И.Кожухов, С,Г.Попова и В.С.Ермаченков (56) Meth Enzymol, 1982, ч. 84, р. 526. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНТАНИЛА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ (57) Использование: в иммунологии, в частности относится к иммунохимическому анализу, и может быть использовано для

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинической медицине для количественного определения фентанилэ.

Одним из наиболее высокочувствительных методов определения фентанила является его радиоиммуноэнализ с чувствительностью 1 пмоль (336 пг).

Цель изобретения — повышение чувствительности определения фентэнила.

Цель достигается. использованием для иммунизации коньюгированного антигена, синтез которого, s отличие от описанного для прототипа осуществляют не при помощи водорастворимого карбодиимида, а взаимодействием смешанного ангидрида карбоксифентанила и изобутилхлорформиата с бычьим сывороточным альбумином, Применение для иммунизации такого анти, Ы,, 1812498 А1 определения фентанила. Сущность изобретения: для иммуноферментного определения фенталина кроличьи антитела к коньюгату бычьего сывороточного альбумина и карбоксифентанила, полученному в реакции смешанных ангидридов и имеющему эпитопную плотность 12, взаимодействующие с твердофазным тест-антигеном, в качестве которого используют с коньюгат гамма-глобулина лошади с карбоксифентанилом, полученный в реакции смешанных ангидридов и имеющий зпитопную плотность 29. Способ позволяет проводить определение фентанила с чувствительностью

2,5 10 ммоля в пробе. 1 табл. гена позволило получить антитела, минимальное ингибирование связывания которых в твердофазном иммуноферментном анализе имело место при добавлении в пробу 2,5 10 ммоля свободного фентанила, что и определило чувствительность способа.

Пример. Синтез гаптена гемисукцината й-фенил-й-4-Я2-фенил-этил)пиперидина) карбоксифентанила). 1,2 г (0,043 моль)

И-фенил-М-4 (2-фенилэтил)пиперидина) растворяли в 20 мл толуола, прибавляли 0,45 г (0.045 моль) янтарного ангидрида в 30 мл толуола и нагревали под аргоном в течение

20 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали эфиром и перекристаллизовывали из смеси бензол: гексан (3: 2).

Выход 1 г (61,3 ). Т.п 188,3 С. Элементный анализ. Найдено: С 72,16 Н 6,9 Й 6,78

1812498

СгэНгзйгОэ. Вычислено: С 72,61 Н 7,39 N

7,42. ИК vсм 1720, 1640(С -О)

Синтез иммуногена. К раствору 0,17 г (0,0456 ммоль) карбоксифентанила в 1,5 мл диметилформамида, охлажденного Π— 2оС, добавляли 50 мкл (0,456 ммоль) й-метилморфолина и при перемешивании на магнитной мешалке прикапывали 59 мкл (0,456 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивали 30 мин и затем постепенно добавляли к охлажденному до 0-2 С раствору 0,50 г (0,075 ммоль) бычьего сывороточного альбумина в 50 мл борно-боратного буфера рН 9. После перемешивания в течение 1 ч при 0-2 С и 18-20 ч при 8 С реакционную смесь центрифугировали (7000 об, 15 мин), Белковую фракцию отделяли от ниэкомолекулярных компонентов гель-фильтрацией на колонке с сефадексом

Г-25 (5 х 30 см), уравновешенном 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 8, содержащим 0,15 M хлористого натрия, концентрировали до объема 10 мл в ультрафильтрацион ной ячейке "Амикон" с фильтром XM-50, промывали несколько раз дистиллированной водой и лиофильно высуиГивали. Получали 0,50 r (100Д по белку) иммуногена, содержащего 12 молей гаптена на. моль белка. Молярную нагрузку(эпитопную плотность) определяли спектрофотометрически {Л- 340 нм, Егапт 458 Оконьюг

0,34 при С = 2,67 мг/мл).

Синтез тест-антигена. Из 0,071 r (0,19 ммоль) карбоксифентанила в 0,5 мл диметилформамида, 21 мкл (0,19 ммоль) М-метил морфолина, 24 м кл (О, 19 м мол ь) изобутилхлорформиата и 0,50 r гаммаглобулина лошади в 50 мл борно-боратного буфера рН 9 по описанной выше методике получали 0,60 г образца, содержащего 167 солей с эпитопной плотностью 29 (it = 340 нм Оконъюг 0,17 при С 2,89 мг/мл). Выход по белку составил 99 .

Антисыворотку. получали из крови кроликов, иммунизированных конъюгатом

"бычий сывороточный альбумин — карбоксифентанил" а количестве 5 мг на животное в полном адъюванте Фрейнда в

20-30 точек области спины подкожно и через каждые 3-4 недели по 10 мг в физиологическом растворе, также s 20-30 точек области спины, Через 7 дней после каждого введения иммуногена, начиная со второго, у животных брали кровь, отделяли сыворотку, которую использовали в иммуноферментйом анализе в количествах, обеспечивающих оптическую плотность субстратной смеси 0,5-1,0. Титр айтисыворотки составил 1 . 1024000.

Проведение анализа. В каждую иэ 96 ячеек полистироловой пластины вносят 0,01 мкг конъюгата "гамма-глобулин лошади— карбоксифентанил" в 0,2 мл 0,05 M карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,5. После инкубации в течение 18 ч при 4 С плату отмывали 0,15 M раствором хлористого натрия, содержащего 0,05 твин-20. В ячейки заливали 0,1 мл раствора фентанила в диа10 паэоне концентраций от 10 до 10 1г ммоль в пробе и затем по 0,1 мл антисыворотки в количестве 0,4 мкг по белку, то есть, разведенную в 150000 раэ. Контрольными являлись ячейки плат, в которые фентанил на

15 добавляли. После часовой инкубации во влажной камере при комнатной температуре платы отмывали и в ячейки помещали 0,2

MR конъюгата ослиных айтикроличьих антител с пероксидаэой хрена(производство Ин20 ститута эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи) при тех же условиях инкубирования. Через час ячейки отмывали и заполняли субстратной смесью, содержащей 8 мг о-фенилендиамина и 7 мкл 33

25 перекиси водорода в 20 мл 0,2 М цитратфосфатного буфера рН 5, Через часа каждой ячейке измеряли поглощение при 490 нм.

Ошибка метода, как правило, составляла не более 5-6 . Результаты выражали в про30 центах по отношению к контролю, прйнятому за 100 .

На основании полученных результатов строилась калибровочная кривая определения фентанила, имеющая 3-образный ха35 рактер с линейным участком s диапазоне от

10ф, до 90 связывания антител с твердой фазой. Согласно полученной кривой, минимально значимое изменение связывания антител к карбоксифентанилу с твердофаз40 ным гаптеном имело место при добавлении в пробу фентанила в количестве 2,5 10 ммоля (0.84 пг), что и определило чувствительность способа.

Предлагаемый способ обладает боль45 шей чувствительностью по сравнению с прототипом и превосходит его а 400 раз, позволяет осуществлять сотни определений одновременно в более короткие сроки (время анализа 4 ч, а для прототипа — сутки), 50 более прост в исполнении, не требует для реализации высококвалифицированного персонала и дорогостоящего, труднодоступного оборудования и реактивов, не связан с радиационной опасностью и проблемой

55 утилизации радиоактивных отходов.

Формуле изобретени« Способ определения фентанила а водных растворах, включающий проведение иммуноанализе, о т,л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности

1812498

Составитель А. Буркин

Техред М. Моргентал

Редактор

Корректор Т. Вашкович

Заказ 1573 Тираж Подписное

ВНИИПИ Гасударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 способа, при проведении иммуноанализа используют кроличьи антитела к конюгату бычьего сывороточного альбумина и карбоксифентанила, взаимодействующие с твердофазным тест-антигеном, при этом конъюгат с эпитопной плотностью 12 получают в реакции смешанных ангидридов. а в качестве тест-антигена используют конъю- гат гамма-глобулина лошади с карбоксифентанилом с эпитопной плотностью 29, 5 который получают в реакции смешанных ангидридов.