Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани

 

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для оценки степени патологического процесса в 2 тканях, формирующих элементы сустава. Цель изобретения - уменьшение объема ткани, необходимого для исследования. Новым в способе является то, что один (даже Очень малый) образец ткани предварительно инкубируют с папаином (10+1000 мг/г) в растворе 0,1+1,0 М ацетатного буфера до визуального растворения ткани (в течение 6+48 ч), затем из полученного тйдролизата отбирают две-пробы, водной из них определяют коллаген по оксипролину, в другой протеогликаны - по гликозаминогли канам. Способ позволяет определять специфические компоненты в любых тканях - хряще, синовиальной оболочке, сухожилиях, мениске и т.д.

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

: (Л

С: а.

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ а (21) 4699806/14 (22) 02.06,89 (46) 30.03,93. Бюл, N 12 (71) Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (72) Д,В.Косягин и Е,В.Карякин (56) Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. М.: Л.: 1969. с (54) СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОНЕНТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ (57) Изобретение относится к клинической биохимии .и может быть использовано для . оценки степени патологического процесса в

Изобретение относится к клинической биохимии и касается комплексного биохимического исследования соединительной ткани, Целью изобретения является уменьшение объема ткани, необходимого для исследования.

Указанная цель достигается тем, что в способе биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем ее: гидрорлиэа и определения коллагена и протеогликанов, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе 10 — 1000 мг/г в растворе 0,1 — 1,0 М ацетатного буфера в течение 6 — 48 ч, затем из гидролизата отбирают две пробы, в одной из них определяют коллаген по оксипролину, в другой — протеогликаны по гликозаминогликанам.

Инкубирование ткани с папаином а дозе 10 — 1000 мг/г в растворе 0,1 — 1,0 М ацетат,, Ы,«, 1805391 А1 тканях, формирующих элементы сустава, Цель изобретения — уменьшение объема ткани, необходимого для исследования. Новым в способе является то, что один (даже очень малый) образец ткани предварительно инкубируют с папаином (10+1000 мг!г) в растворе 0,1+1,0 М ацетатного буфера до визуального растворения ткани (в течение

6+48 ч), затем иэ полученного гидролизата отбирают две.пробы, в одной из них определяют коллаген по оксипролину, .в другой протеогликаны — по гликозаминогликанам, Способ позволяет определять специфические компоненты в любых тканях — хряще, синовиальной оболочке, сухожилиях,мениске и т.д. ного буфера в течение определенного времени (в зависимости от типа исследуемой ткани) позволяет перевести образец в жидкое состояние, что облегчает последующее разделение малого объема ткани на две про-, бы для комплексного биохимического, исс- ледования.

Меньшее, чем 10 мг/г количество папа-: ина и меньшая, чем 0,1 М емкость буфера не позволяют полностью выделить гликозаминогликаны даже иэ той ткани (хрящ), из которой они выделяются при наиболее мягких условиях протеолиза. Увеличение количества папаина более 1000 мгlг ткани и повышение емкости буфера свыше 1,0 М нецелесообразно, т.к. не дает дополнительного положительного эффекта, а лишь приводит к дополнительному расходыванию реактивов.

Продолжительность протеолиза менее

6 ч не позволяет полностью выделить все

1805391 гликоэаминогликаны, содержащиеся в ткани. а увеличение времени инкубации более

48 ч нецелесообразно, т.к. за 48 ч происходит полное растворение исследуемых тканей, Способ осуществляют следующим образом.

После взвешивания (при необходимости обезвоживания, обезжиривания) ткань инкубируют с папаином (10 — 1000 мг на 1 т ткани) в растворе 0,1-1,0 M ацетатного бу фера"до визуального растворения ткани (648 часов), Полученный гидролизат делят на две пробы. В одной пробе проводятопределение содержания коллагена, по входящему в его состав оксипролину после гидролиза в соляной кислоте. В другой пробе проводят определение содержания протеогликанов по входящим в их состав гликозаминогликанам после депротеинизации пробы, осаждения и очистки гликозаминогликанов.

Пример. Исследование компонентов суставного хряща надколенника, полученного при пункцион ной биопсии больного артрозом. Хрящ массой 5 мг обезжирен эфиром, высушен на воздухе при комнатной температуре, помещен в бюкс с притертой пробкой. В бюкс добавлен 1 мл 0,1 М рас твора ацетатного буфера рН 5,7-5,8, содержащего 50 мг папаина и его активаторы

ЭДТА и L-пистеин (по 0,1 М) на 1000 мл буфера. Протеолиз,проведен при 60 + 4 С при периодическом встряхивании в течение

6 часов. Из гидролизэта отобраны две пробы — 0,02 и 0,2 мл, В меньшей пробе проведено определение коллагена по оксипролину. К 0,02 мл гидролиэата, помещенного в ампулу, добавляют 2 мл 6 н раствора соляной кислоты, ампулу запаивают, помещают в термостат при 110 С на 20 часов, ампулу вскрывают, соляную кислоту выпаривают досуха, Остаток растворяют в 2 мл воды и проводят определение оксипролина, добавляя 1 M/1 забуференного реактива окислейия (состоящего из 2,82 г хлорамина

Т или В, растворенного в 40 мл воды и 60 мл метанола и 100 мл ацетет-цитратного буфера рН 6,0), оставляя пробу на 20 мин при комнатной температуре, добавляя потом I мл 4 M раствора хлорной кислоты, встряхи-. вая, оставляя на 5 мий при комнатной температуре, добавляя 1 мл 10% раствора пара-диметилбензальдегида в метаноле, фотометрируя при длине волны 560 нм. Содержание оксипролина 26 мг/г ткани.

В большей пробе проведено определе-":йие содержания протеогликанов по гликозаминогликанам. К 0,2 мл гидролизата добавляют трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 10 . оставляют при

Формула изобретения

Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем ее гидролиза и определения коллагена и протеогликанов, отличающийся тем, что, целью уменьшения объема ткани, необходимого для исследования, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе

10 — 1000 мг/г в 0,1 — 1,0 M ацетатном буфером растворе в течение 6-48 ч, затем иэ гидролизата отбирают две пробы, в одной иэ них определяют коллаген по оксипропину, в другой — протеогликсану по гликозаминогликанам.

4 (; на 4-24 ч, Остаток отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осаждение гликозаминогликанов из надосадочной жидкости, содержащей трих5 лоруксусную кислоту, проведено с помощью добавления к ней 96 зтанола, содержащего соли натрия или калия уксусной кислоты до конечной концентрации этанолэ 67 . Проба тщательно перемешана и оставлена при 4 С на 12-24 ч, Осадок отделен центрифугиро-, ванием, растворен в воде и гликозаминогликаны повторно осаждены, В осадке гликозаминогликанов определяли содержание уроновых кислот, добавляя к нему 0,1 мл

0 5 M раствора борной кислоты, 0,2 мл 1 M раствора сульфаминовой кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты, тщательно перемешивают, нагревая на кипящей водяной бане 6,5 мин, охлаждая, 20 добавляя 0,1 мл 0,2% раствора карбэзола в этаноле, пробу тщательно смешивая и повторно нагревая на кипящей водяной бане

10 мин, охлаждая и измеряя полученную окраску на спектрофотометре при длине волны 525 нм. Содержание гликозаминогликанов 5,7 мг/г ткани.

Исследование компонентов соединительной ткани синовиальной оболочки, сухожилия надколен ника и мениска коленного сустава проводится аналогичным образом, при этом учитывается масса ткани, Молярность буфера и количество растворя: емого в нем папаина, а также время инкубации определяются типом анализируемой ткани.

Предлагаемый способ позволяет упростить процедуру. исследования ткани путем сокращения ряда приемов и расширить возможности его клинического применения за

40 счет исследования минимальных количеств ткани, например, биоптатов, провести комплексное биохимическое Исследование для получения необходимой информации о состоянии волокнистых структур и матрикса соединительной ткани.