Способ определения токсичности промышленных сточных вод

 

Использованиеопределение токсичности промышленных сточных вод. установление токсичности сточных вод отдельных производств, оценка функционального состояния экосистемы активного ила. Сущность изобретения: из проб активного ила определяют фракции белков, устанавливают молекулярные формы малатдегидрогеназы и определяют активность в опытных и контрольных средах. Опытную среду относят к токсичной в случае снижения активности одной из форм малатдегидрогеназы в опытной среде более чем на 20% по сравнению с контролем 3 ил., 6 табл.

СОВХОЗ СОВЕ ТСКИХ

СО! ИАЛИСТ11 Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

Г19) П I) (sI>s G 01 N 33/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ чества сточных вод (от 10 до 50 мл в зависимости от вероятной токсичности) или компонентов сточных вод в разных концентрациях, Колбы помещают на магнитные мешалки и, перемешивая, прово дят инкубацию в течение 1 ч при 370, По оконча- нии инкубации из контрольной и опытных образцов берут по 10 мл иловой суспензии, 3-кратно промывают фосфатным буфером рН 7,0, центрифугируют при 5000 об/мин 10 (Л мин. Осадок переносят в механический дезинтегратор, дезинтеграцию проводят 5 мин 0 при 40. Дезинтегрируемую иловую смесь переносят в колбу, добавляют 5 мл фосфатного буфера рН 7,0.и тритона Х-100 20 мг/мл в конечной концентрации, Колбы помещают на магнитные мешалки и продолжают дезинтеграцию и солкбилиэацию белков 2 ч а при 37 С. Дезинтеграт центрифугируют при

8000 об/мин в течение 10 мин, В супернатанте определяют общее количество белка биуретовой реакцией и фракции белков методом электрофореза в плоских блоках полиакриламидного геля. Для этого аналиэиf ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4756133/13 (22) 01.11.89 (46) 30,07.92.Бюл. ¹ 28 (71) Самарский медицинский институт им, Д.И.Ульянова (72) И.Ф. Шаталаев, С, В. Первушкин, Т.Б.Волгина, Е.В.Щеголева и А.Д.Либерман (56) Авторское свидетельство СССР

N 1684664, кл, G 01 N 33/18, 1989. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД.

Изобретение относится к биологической очистке промышленных сточных вод, может быть использовано для установления токсичности сточных вод отдельных производств, индивидуальных компонентов и многокомпонентных систем загрязнителей при приеме на биологическую очистку и сбросе в водоемы, а также для оценки функционального состояния экосистем активного ила и оперативного контроля за работой, сооружений биологической очистки.

Известен способ биотестирования токсичности промышленных сточных вод, заключающийся в установлении нарушения способности белков микроорганизмов эко. системы активного ила связывать специфический краситель при действии токсичных сточных вод и их компонентов.

Способ осуществляют следующим образом: в колбы помещают по 200 мл иловой суспензии действующих очистных сооружений. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую (ие) добавляют разные колиТЕНИЯ

1 ---"I (57) Использование: определение токсичности промышленных сточных вод, установление токсичности сточных вод отдельных производств, оценка функционального состояния экосистемы активного ила. Сущность изобретения: иэ проб активного ила определяют фракции белков, устанавливают молекулярные формы малатдегидрогеназы и определяют активность в ortbITHbIx u контрольных средах, Опытную среду относят к токсичной в случае снижения активности одной из форм малатдегидрогеназы в опытной среде более чем на 20% по сравнению с контролем. 3 ил.. 6 табл.

1751670 руемые образцы в объеме 50 мкл в смеси с

40%-ным раствором сахарозы наносят на линию старта. В качестве электродного буфера используют 1 M трис-ЗДТА-боратный буфер рН 9,2, Электрофорез проводят при силе тока 5,0 мА/см в первые 30 мин, затем

10,0 мА/см до окончания электрофореза.

Фракции белков фиксируют и окрашивают, для чего электрофореграммы помещают в

1%-ный раствоо амидочерного в 7%-ной уксусной кислоте на 10 мин, Удаление избытка красителя проводят вымачиванием гелевых пластинок в 7%-ной уксусной кислоте. Для ускорения обесцвечивания фона раствор уксусной кислоты меняют 4 раза в день, Для качественной оценки действия токсичных сточных вод и их компонентов на микроорганизмы активного ила достаточно визуального исследования электрофореграмм без сканирования гелей, Действие минимальных токсичных концентраций компонентов сточных вод приводит к изменению электрофоретической подвижности фракций белка по сравнению с контролем, причем фракции выявляются в виде "подков с зубчиками на краях", что указывает на начало токсического действия сточных вод и их компонентов на микроорганизмы активного ила. Увеличение концентрации токсичных компонентов ведет к постепенному увеличению нарушения фиксирования белками микроорганизмов ила красителя вплоть до полного исчезновения окрашенных фракций с поля электрофореграмм, Недостатками известного способа яв.ляются его незначительная точность и информативность, поскольку неизвестно, какие именно белки — ферментные или неферментные — подвержены действию токсикантов, следствием чего является нарушение их структурных особенностей.

Цель изобретения — увеличение точности способа определения токсичности компонентов промышленных сточных вод по отношению к микроорганизмам активного ила, Способ осуществляют следующим образом.

В колбы помещают по 200 мл иловой суспензии действующих очистных сооружений. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую (ие) добавляют компоненты сточных вод в концентрациях, соответствующих залповым сбросам существующих производств, Колбы помещают на магнитные мешалки и; перемешивая, проводят инкубацию в течение 1 ч пир 37 С. Продолжительность и температура инкубации установлены в результате оптимизации условий эксперимента. По окончания инкубации из контрол ной и опытных образцов берут по

10 мл иловой суспензии (45--50 мг сухого остатка), 3-кратно промывают фосфатным буфером рН 7,0, центрифугируют при 5000 дят 5 мин при 4"С. Дезинтегрируемую иловую смесь переносят в колбу, добавляют 5 мл фосфатного буфера рН 7,0 и тритона X10020 мг/мл в конечной концентрации. Колбы помещают на магнитные мешалки для солюбилизации белков на 2 ч при 37 С. Гомогенат центрифугируют при 8000 об/мин.

10 мин, В супернатанте определяют молекулярные формы малатдегидрогеназы методом электрофореза в плоских блоках

20

30 следующего состава: 0,1 M трис-HCl буфер

1 M раствор малата натрия рН 7,1 10 мл, вода дистиллированная 70 мл. НеспецифиГелевые блоки заливают инкубационным раствором и инкубируют 2 ч при 37 С. Мо40

55 являются в виде темно-синих зон. Путем прямой денситометрии определяют относительную активность каждой зоны в контрольной и опытных образцах. Снижение активности одной из молекулярных форм малатдегидрогеназы микроорганизмов активного ила (маркер токсичности) на 20% от контроля является критерием токсичности.

Малатдегидрогеназа участвует в переносе восстановленных эквивалентов через мембранные системы клетки. Угнетение активности малатдегидрогеназы при действии токсикантов приводит к блокированию участка цикла Кребса малат-оксалоацетат, следствием чего вляется нарушение окислительно-восстановительных процессов в микроорганизмах активного ила и ухудшение качества очистки.

Пример 1, В две колбы помещают по

200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод нефтеперера5 об/мин 10 мин. Осадок переносят в механический дезинтегратор (стеклянная ступка и пестик на шлифах), дезинтеграцию провоила проводят феназинметасульфат-тетразолиевой реакцией в инкубационной среде рН 7,1 — 15 мл, НАД-30 мг, нитросиний тетразолиевый 10 мг, феназинметасульфат 2 мг, 35 ческие реакции исключают использованием инкубационной среды без малата натрия. лекулярные формы малатдегидрогеназы вы1751670 батывающего завода. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую добавляют синтетического моющего средства "Прогресс" (CMC "Прогресс" ) в количестве 110 мг/г ила, К указанному детергенту активный 5 ил адаптирован, Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при 37 С. Дезинтеграцию микроорганизмов ила, получение ферментных образцов, электрофорез и выявление молекулярных 10 форм малатдегидрогеназы микроорганизмов ила осуществляют вышеописанным способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены на табл. 2 и фиг. 1, 15

Из табл. 1 и 2 видно, что по известному способу действие CMC "Прогресс" в концентрации 110 мг/г ила приводит к уходу одной фракции с поля злектрофореграмм.

Это указывает на высокую токсичность де- 20 тергента в таких количествах для микроор ганизмов активного ила. Данные по предлагаемому способу показывают полное ингибирование 8-й зоны малатдегидрогеназы и значительное ингибирование осталь- 25 ных семи молекулярных форм МДГ, что говорит о практически полном блокировании фрагмента цикла Кребса малат-оксалоацетат и недопустимости приема на биологическую очистку исследуемого дете р- 30 гента в таких концентрациях, Пример 2; В две колбы помещают по

200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод нефтепереработывающего завода, Одну колбу 35 составляют в качестве контроля, в другую добавляют цинка сульфата 35 мг/г ила, характерного для сточных вод завода. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при 37 С. Дезинтегра- 40 цию, получение ферментных образцов, злектрофорез и выявление молекулярных форм малатдегидрогеназы проводят аналогичным способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены на 45 табл. 3 и 4 и фиг. 2.

Данные показывают, что по известному способу цинка сульфат вызывает "уход" двух фракций белка с поля электрофорег- 50 рамм, характеризуя его как высокотоксичное соединение для активного ила в исследуемой концентрации. По предлагаемому способу установлено полное ингибирование 8-й зоны, что указывает на 55 блокирование фрагмента цикла Кребса, нарушение окислительно-восстановительных процессов в экосистеме с вероятной возможностью вывода из строя биоочистных сооружений.

П р и м е; 3. В две колбы помещают по

200 мл иловой суспензии 1-й ступени биоло гической очистки сточных вод нефтеперерабатывающегоо завода. Одну колбу оставляют для контроля, в другую добавляют ортокрезола 350 мг/г ила, к указанному фенолу ил адаптирован. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при

37 С. Дезинтеграцию, получение ферментных образцов, электрофорез и выявление молекулярных форм малатдегидрогеназы проводят вышеописанйЪ|м способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены в табл. 5 и б и фиг. 3.

Полученные данные по известному способу свидетельствуют о выраженной токсичности оото-крезола в исследуемой концентрации по отношению к микроорганизмам активного ила, подтверждением чего является уход однбй фракции с поля злектрофореграмм. По предлагаемому способу установлено ингибирование активно сти зоны два на 92;, зоны три на 977,, зоны четыре на 84 и зоны пять на 96 /, что несомненно указывает на глубокое нарушение функционирования экосистемы активного ила на участке цикла Кребса малат-оксалоацетат..

Применение предлагаемого способа определения токсичности компонентов промышленных сточных вод позволит получить более точную и полную информацию о ингибирующем влиянии загрязнителей на ферменты активного ила, определить функциональное состояние экосистемы нэ уровне одного из ключевых ферментов цикла

Кребса, лимитирующего процессы окисления и дыхания.

Использование способа на сооружениях биологической очистки обеспечит санитарный эффект за счет тонкого контроля состояния сточных вод промышленньlx производств при приеме на биологическую очистку и выбросе в водоемы, Формула изобретения

Способ определения токсичности промышленных сточных вод, предусматривающий отбор проб микроорганизмов активного ила, их инкубацию в средах с компонентами сточных вод и KoHTpoльной чистой водой, последующее центрифугирование сред, дезинтеграцию, определение фракций белков злектрофорезом в плоских блоках полиакрилполиамидного геля, окрашивание фракций белка с установлением молекулярных форм фермента и их активности в опытных и контрольных средах и отнесение опытной среды к токсичной в случае

1751670

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4. изменения активности молекулярных форм фермента в опытной среде по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве фермента используют малатдегидрогеназу, окрашивание фракций белка проводят феназинметасульфата-тетразолиевой реакцией, при этом активность молекулярных форм фермента устанавливают денситометрией, а отнесение опытной среды к токсичной проводят в случае снижения ак5 тивности одной из форм фермента в опытной среде более чем на 20% по сравнению с контроле м.

Таблица 5

Таблица 6

1751670

Фиг. 2

8 Ю Ф 3 z

Составитель И.Шаталаев

Техред М.Моргентал Корректор,Т,Вэшкович

Редактор А.Долинич

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5