Способ анализа воды на содержание вируса гепатита а

 

Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно из воды . Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепатита А в больших объемах воды разной степени загрязненности, упрощение и удешевление способа Дляэтого адсорбцию вируса гепатита А из подкисленной соляной кислотой до уровнярН ,5 анализируемой пробыосуществляютн,-; кристаллическом гидрате окиси алюминия в форме гицраргиллита с последующей элюцией 0,05 М глицериновым буфером рН 11,5,нейтрализацией до уровня рН 7,0- 8,0, проведения антимикробной обработки хлороформом, концентрацию и анализ на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФ. 1 табл. , 1 ил. с С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (g1)g, 01 N 33/18

00ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ CCCP

t(21 ) 4753028/13 (22) 25.10 .89 (46) 23.05,92.Бюл, Ь" 19 (71) Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) А,Н, Бурков, MÄ. 1, Алейник, К.В„ Блохин и С,В. Зубов (53) 578.8,.094,29(088.8) (56) 4ortins И.T,, Nargues E,, Soare s Ь .А., "А compa ra t ive study of

methods for concentrations of human

entегоviruses йrom Sewage", Nator, Sc i

and Technol., 1982, v. 14, .N 4-5, р. 273-279.

Брок Т. мембранная фильтрация, И, Нир, 1987, с. 462.

Красильников И.В., Казанцева В.А,, Иванова 0.Е. и др, Выделение вирусов из воды с использованием пористого кремнеземов, — Вопросы вирусологии, 1985, т, 30, Н 5, с, 608-610, Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита А, в частности выделению вируса гепатита A из объектов окружающей среды, а именно воды, Известен способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на пропускании воды через мембранные фильтры (1): Данный способ .заключается в адсорбции вирусов на мембране с размером пор порядка 0,Ц5 мкм с последующей их десорбцией, Известен также способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на адсорбции виру" сов на пористых кремнеземах 1 2) ., Не2 (54) СПОСОБ АНАЛИЗА ВОДЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ВИРУСА ГЕПАТИТА А (57) Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно из во,ды, Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепатита A в больших объемах воды разной степени загрязненности, упрощение и удешевление способа. Для этого адсорбцию вируса гепатита A из подкисленной соляной кислотой до уровня рН 3, 0-4, 5 анализируемой пробыосуществляютн» кристаллическом гидрате окиси алюминия в форме гицраргиллита с последующей элюцией 0,05 M глицериновым буфером рН

19

11,5 нейтрализацией до уровня рН 7,0- g/

ЪД (8,0, проведения антимикробной обработки хлороформом, концентрацию и анализ на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФА. 1 табл., 1 ил. достатком описанных способов анализа воды на содержание вирусов является: для первого способа — необходимость наличия специального дорогостоящего ,оборудования и материалов (микрофильтры), для второго использование для анализа лишь небольших объемов (до

10 л) вирусосодержащей жидкости, что резко снижает потенциальные возможности метода, Наиболее близким по технической сущности и ожидаемому положительному эффекту к предлагаемому изобретению является способ анализа воды на налиЭ 17357 чие энтеровирусов, основанный на адсорбции их на аморфном осадке гидрата окиси алюминия (31 .

Авторами был воспроизведен данный способ применительно к анализу раэли чных видов воды на содержание вируса гепатита А, Способ заключается в следующем, В и ри г отовле нные модел ь ные растворы с известным содержанием ви10 руса гепатита А вносят аморфный Гидрат окиси алюминия, доводят рН др уровня 3,0-4,5 соляной кислотой и при перемешивании инкубируют в течение ночи, Осадок отделяют низкоскоростным центрифугированием. Злюцию вируса îñóf5 ществляют 0,05 М глициновым буфером рН 11,5, нейтрализуют рН 7,0-8,0

0,05 М глициновым буфером рН 1,5, проводят антимикробную обработку хлоро- формом, концентрируют ультрафильтрацией до минимального объема и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), Однако к недостаткам этого способа относится: невысокая степень выявления вируса гепатита А, которая составляет в среднем 20-25 ; от внесенного количества и воэможность осуществлять анализ" небольших объемов жидкости, поскольку возникают технологические трудности в выделении осадка, Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепати- З5 та A в больших объемах воды разной степени загрязненности и его упрощение.

Поставленная цель достигается тем, что вместо аморфного гидрата окиси 40 алюминия для адсорбции вируса гепатита А из воды используют кристалличес.кий гидрат окиси алюминия в форме гидраргиллита„.

Способ осуществляют следующим об- 45 разом.

Анализируемую воду подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через одну или несколько колонок, заполненных кристаллическим Я гидратом окиси алюминия из расчета см > на 10 л анализируемой воды со скоростью 1,0-20 мл/мин, элюцию проводят 0,05 t1 глициновым буфером рН

11,5, нейтрализуют рН до 7,0-8,0 55

0,05 М глициновым буфером рН i,5, затем осуществляют антимикробную обработку хлороформом, доводят объем элю67 4 ата ультрафильтрацией до нескольких миллилитров и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи ИфА, Способ поясняется следующими примерами, Пример 1. Питьевую воду объемом 10 л с внесенным в нее культуральным вирусом гепатита А (штамм НА

15) в концентрации в 1000 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА, подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия объемом 1 смз со скоростью

10-20 мл/мин, После прохождения воды через колонку пропускают десорбирующий 0,05 М глициновый буфер рН 11,0„

Злюат нейтрализуют до уровня рН 7,00,0, используя 0,05 М глициновый буфер рН 1,5, проводят антимикробную обра" ботку хлороформом, концентрируют ультрафильтрацией до конечног0 объема

5 мл и анализируют на наличие специфической активности при помощи ИФА.

Проводят количественное определение антигена вируса гепатита А, которое в данном случае составляет 983 от внесенного.

Пример 2, Проведение анализа осуществляют как в примере 1, за ис - ключением того, что вместо культурального вируса гепатита А (штамм НА - 15) используют "дикий" вирус, выделенный от больного вирусным гепатитом A.

Результаты полностью идентичны полученным с использованием культурального вируса, Пример 3. Проведение анализа осуществляют, как в примере 1, за исключением того, что для проведения анализа используют сточную воду, Количественное содержание нтигена вируса гепатита А, определяемое при помощи

ИФА, составляет в данном случае 80

90;; от внесенного количества, I

Пример 4, Сточную воду объемом 1 л с внесенным в нее вирусом гепатита А в концентрации в 100 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4.5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия с различной скоростью

Установлено, что сорбционная емкость гидрата окиси алюминия была максимальной и оставалась неизменной при

Наименование десорбирующего буфера

Показатели экстинкции

0fl 492 нм

Процент

"выхода" вируса

0>576

0,5 М трис буфера рН 8 5

0,5 М фосфатный буфер рН 8,2

70,0

34,0

О, 281

5 1 735767 б скорости пропускания сточной воды че- используя 0,05 глициновый буфер рез колонку от 1 до 20,0 мл/мин, Яаль", pal 1,5. нейшее увеличение скорости лимитиро- Злюаты с колонок объединяют и провалось гидравлическим сопротивлением изводят антимикробную обработку хлоро и забиванием колонки взвешенными в формом, концентрируют ультрафильтрасточной воде твердыми частицами, цией до конечного объема 5 мл и анали

П р и и е р 5, Проведение анализа зируют на наличие специфической антиосуществляют, как в примере 3, но . генной активности при помощи ИФА, Ан« анализируемую сточную воду перед про- тиген вируса гепатита А был определен пусканием через колонку с кристалли- в разведении 1:8, Кроме того, часть ческим гидратом окиси алюминия не элюата после дополнительного освобожподкисляют, Установлено снижение выхо- дения от контаминирующей бактериальда вируса до 50;;, ной флоры при помощи стерилизующей

Оптимальную адсорбцию получают при фильтрации была использована для эараl5 значениях рН между 3,0-4,5 (см.черт.) . .жения культуры клеток FrHK-4, После

Пример 6. Проведение анализа . трек пассажей вирус гепатита A был обосуществляют, как в примере 1 за ис- наружен при помощи ИФА. Наличие вируса ключением операции элюирования, кото- гепатита А подтвердили, используя рую проводят с использованием различ- О непрямой иммунофлюоресцентный метод. ных десорбирующих буферов. В таблице использование предложенного cnocoba приведены результаты использования позволит увеличить степень выявления в качестве десорбирующих буферов вируса гепатита А, которая не зависит

0,5 М три - буфера с рН 8 56; 0.,5 М от вида и степени загрязненности анафосфатного буфера с рН 8,Z; 3ь мясным лизируемой воды по сравнению с иээкстрактом с рН 9,0; 0,05 глициновым вест ным способом, а та кже - эна чи- . буфером с рН 11,5. тельно упростить анализ эа счет исПредставленные в таблице реэульта ключения этапа низкоскоростного центты свидетельствуют, что наилучшие ре- рифугирования, воэможности использовазультаты получают при использовании в ния простейшего оборудования отечесткачестве десорбирующего О;05 М глици- венного производства, нового буфера с рН 11, 5.

П ример 7, Сточную воду объе- Формула изобретения мом 30 мл отобранную из канализацион- ного коллектора детского дошкольного Способ анализа воды на содержание учреждения по эпидемическим показа- gg вируса гепатита А путем пропускания ниям (зарегистрировано несколько слу- воды через колонку с сорбентом, провечаев заболеваний вирусным гепати- дение элюции, очистки от микрофлоры том А), подкисляют соляной кислотой . и определения в элюате специфической до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают че- вирусной активности при помощи ИФА, реэ две колонки с кристаллическим гид" 40 отличающийся тем, что, с ратом окиси алюминия общим объемом целью повышения степени выявления ви20 см со скоростью 5-20 мл/мин„Пос- руса гегатита А и его упрощения, в

3 ле прохождения воды пропускают де- качестве сорбента используют кристалсорбирующий 0,05 М глициновый буфер лический гидрат окиси алюминия в фор11,5, нейтрализуют до уровня 7,0-8.0, 45 ме гидраргиллита.

Изучение эффективности десорбции вируса гепатита

А с кристаллического гидрата окиси алюминия в зависимости от используемого буфера

1735767

Продолжение таблицы

3 мясной экстракт рН 9,0

0,05 1 глициновый буфер рН 11,5

91,0

0,752

98,0

0,810

Примечание: объем элюата во всех случаях был одинаков и равнялся 5 мл.

Ацс орбцкя вируса,/ I

-s0

2 4 6 8 IO pH

Составитель А, Бурков

Техред ц,дицык Корректор Л. Пилипенко

Редактор А, Зробок

З 1ЕЛ Тираж . Подписное

ВНИИПИ Госуцарственного комитета о изобретенилм и открытилм при ГЕНТ СССР

113035, Иосква, 3-35, Рауаекал наб., д. 4/S

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, уп. Гагарина, 101