Способ определения интерлейкина-1 моноцитов человека

 

Использование: изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии , и может быть использовано в диагностике состояния иммунной системы. Цель изобретения - упрощение, ускорение и повышение точности определения ИЛ-1 моноцитов человека. Моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение 1,5-3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мм) суспензии аутологичных лимфоцитов и фитогемагглютинин в субоптимальной дозе и после культивирования подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансфор,мации. Положительный эффект изобретения заключается в упрощении.ускорении и повышении точности определения ИЛ-1 за счет импульсной активации (1,5-3 ч) моноцитов липополисахаридом и использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноцитов и лимфоцитов). 2 ил. 1 табл.

СОЮЗ, СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г

l

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4765398/14 (22) 04.12.89 (46) 30.04,92. Бюл. N 16 (71) Витебский медицинский институт (72) Г.П.Адаменко (53) 615,375(088,8) (56) Иммунология, 1986, N. 4, с. 52-54. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРЛ)=ЙКИНА-1 МОНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в диагностике состояния иммунной системы. Цель изобретения — упрощение, ускорение и повышение точности определения ИЛ-1 моно-. цитов человека, Моноциты крови после

Изобретение отностися к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в диагностике состояния иммунной системы.

Цель изобретения — упрощение, ускорение и повышение точности определения

ИЛ-1 моноцитов человека.

Поставленная цель достигается тем, что моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение 1,5 — 3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мл) суспензии аутологических лимфоцитов и фитогемагглютинин и после культивирования смеси клеток подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансформации.. Ж 1730594 А1 отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение

1,5 — 3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мм) суспензии аутологичных лимфоцитов и фитогемагглютинин в субоптимальной дозе и после культивирования подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансформации, Положительный эффект изобретения заключается в упрощении,ускорении и повышении точности определения ИЛ-1 за счет импульсной активации (1,5 — 3 ч) моноцитов липополисахаридом и использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноцитов и лимфоцитов). 2 йл. 1 табл.

Способ осуществляют следующим образом.

Гепариниэированную(20 ЕД), венозную кровь в объеме 5 — 6 мл наслаивают на 2 мл градиента Фиколл-Гипак(1,077 г/см ) в цен3 трифужной пробирке и центрифугируют при

400 g 40 мин, Фракцию мононуклеаров, находящуюся в интерфазном слое, собирают, отмывают три раза физиологическим раствором и приготавливают суспензию клеток доконцентрации2х10 в1млсреды RRM1 — 1640 с 10 -ной инактивированной AB(IV) сывороткой. Для разделения прилипающих и неприлипающих клеток суспензию мононуклеарных клеток разливают по 0,2 мл на одну лунку в пластиковые плоскодонные планшеты для культивирования клеток и инкубируют в течение 45 мин при 37 С и 5%

COz. Неприлипшие клетки, состоящие на

95 Д из лимфоцитов (окраска азур-эозином) 1730594

50

55 собирают и хранят при 4 С до использования. Прилипшие клетки, состоящие на 92) из моноцитов (окраска на неспецифическую эстеразу), осторожно промывают несколько раз средой 199 и во все лунки добавляют по

0,1 мл среды РРМ1 — 1640. Клетки активируют липополисахаридом Е. Coll (ЛПС

"Serva") импульсным методом. Для этого в часть лунок с моноцитами вносят по 0,02 мл (20 мкгlмл) ЛПС, в другие — 0,02 мл среды

RPM1 — 1640 и инкубируют при 37 С и 5;(, С02 в различные интервалы времени (0,5;

1,5; 3,0 ч). По окончании удаляют всю надосадочную жидкость и лунки с клетками осторожно промывают три- раза средой 199.

Затем в монослой моноцитов (активированных и неактивированных ЛПС) вносят по 0,2 мл суспензии аутологичных неприлипших клеток (лимфоцитов) в концентрации 2х10

6 на 1 мл среды RPM1 — 1640 с 20 мМ глутамина, 10 / инактивированной АВ (И) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. В часть лунок (опыт) с клеточными смесями, состоящими из активированных или интактных моноцитов и лимфоцитов, добавляют субоптимал ьную дозу (1 мкг/мл) Ф ГА в объеме 0,02 мл. В другие (контроль) вносят равный объем среды RPM1—

1640. Планшеты помещают в термостат при

37 Сc5g СО2и культивируютвтечение 72 ч.

По окончании реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) готовят мазки клеток, в которых определяют бластные клетки, РБТЛ с исходными мононуклеарными клетками и с неприлипшими клетками (лимфоциты) ставят с целью контроля спонтанного и митогениндуцированного пролиферативного ответа клеток. Для этого в лунки помещают по 0,2 мл суспензии клеток с концентрацией 2х10 на 1 мл среды RPM1 — 1640 с 20 мМ глутамина, 10Я, инактивированной AB(IV) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина, В опытные лунки добавляют 0,02 мл ФГА (10 мкг/мл), в контрольные лунки — такое же количество среды и культивируют при 37 С с 5 СО в течение 72 ч с последующим определением бластных клеток.

РБТЛ во всех исследованиях оценивают по индексу активации (ИА) — отношение числа бластных клеток в культурах, обработанных

ФГА (опыт), к количеству бластных клеток в культурах, не обработанных Ф ГА (контроль).

Для оценки продукции ИЛ-1 моноцитами используют индекс восстановления реакции бласттрансформации (ИВРБ).

Лимфоциты + моноциты, активированные ИА импульсным методом, или интактные моноциты — ИА (лимфоциты) ИВРБ—

ИА (мононуклеары)—

ИА (лимфоциты) 5

В части исследований ИЛ вЂ” 1 определяют в суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом, а также в суточных супернатантах интактных моноцитов согласно изобретению, Для этого монослой клеток инкубируют с или без

ЛПС в течение 0,1; 1,5; 3 ч. Затем их осторожно промывают три раза средой 199 от индуктора, суспензируют в среде RPM1

1640 и культивируют в течение 1 сут при

37 С с 5ф> С02. Затем собранные супернатанты центрифугируют при 400g 15 мин и определяют в них активность ИЛ-1. Полученные данные выражают в ИВРБ.

ИА (лимфоциты) + ИЛ) - ИА (лимфоциты)

ИВРБ ——

ИА (мононуклеары ) — ИА (лимфоциты ). где ИЛ вЂ” суточные супернатанты моноцитов, активированных импульсным методом ЛПС или интактных моноцитов.

Полученные результаты подвергают статистической обработке с применением критерия Стьюдента.

Результаты. Интактные моноциты стимулируют пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА по сравнению с пролиферацией одних лимфоцитов (фиг.1).

Однако эти клетки не способны восстанавливать пролиферацию лимфоцитов до показателей, полученных в РБТЛ с мононуклеарными клетками, так как ИВРБ равен 0,6 «-0,09. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию лимфоцитов существенно не отличается от действия интактных клеток (фиг,1), Пролиферативный ответ лимфоцитов значительно возрастает (P < 0,05) после активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 ч и сохраняется при применении моноцитов, активированных ЛПС 3 ч (фиг.1), Полученные данные свидетельствуют о том, что после импульсной активации

ЛПС моноциты приобретают способность усиливать пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА, ЛПС является хорошим индуктором продукции ИЛ вЂ” 1 моноцитами, Поэтому предполагается, что после импульсной активации ЛПС моноциты человека приобретают способность продуцировать ИЛ вЂ” 1, который стимулирует пролиферацию аутологичных лимфоцитов. Для подтверждения этого с помощью известного способа определяют ИЛ-1 в суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом. Кроме того, известным спо1730594

Способ

0,92 0.12

1,35 0,10

Известный

П редла гаем ый собом определяют ИЛ-1 в суточных супернатантах интактных моноцитов человека, Оказалось, что супернатанты интактных клеток стимулируют пролиферацию лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу

Ф ГА. И В Р Б в этих случаях равен 0,92 + 0,12 (фиг.2), что видно по результатам, полученным согласно известному способу, Увеличение ИВРБ наблюдается при использовании супернатантов моноцитов, активированных

ЛПС импульсным методом в течение 1,5 и 3 ч (фиг.2), в то время как супернатанты моноцитов, активированных ЛПС в течение 0,5 ч, не обладают таким действием (фиг.2), Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что моноциты, активированные ЛПС импульсным методом, приобретают способность продуцировать

ИЛ-1, который определяется в суточных супернатантах этих клеток с помощью известного способа.

Таким образом, приведенные данные показывают, что моноциты, активированные ЛПС импульсным методом, продуцируют ИЛ вЂ” 1, который определяется по стимуляции пролиферации аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА.

Пример 1, Исследования проведены на крови 25 доноров станции переливания крови. Статистически обработанные результаты представлены на фиг.1. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА существенно не отличается от действия интактных моноцитов.

Это указывает на то, что в обоих случаях определяется одинаковая способность моноцитов человека продуцировать ИЛ вЂ” 1. При активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 и 3 ч возрастает (Р 0,05) пролиферативный ответ лимфоцитов на субоптимальную концентрацию ФГА, На основании полученных данных можно считать, что моноциты человека, активированные ЛПС импульсным методом (1,5 — 3 ч), продуцируют ИЛ вЂ” 1, который определяется по способности стимулировать пролиферацию аутологичных лимфоцитов, стимулированных субопти5 мальной дозой ФГА, Пример 2. Проведено определение

ИЛ вЂ” 1 моноцитов человека по известному и предлагаемому способам у 30 доноров станции переливания крови.

10 Данные представлены в таблице, При использовании известного способа определено одинаковое количество ИЛ-1 (ИВРБ = 0,92 + 0,12), При определении ИЛ—

1 моноцитов человека предлагаемым спо15 собом ИВРБ равен 1,35 "=0,1, что выше данных по известному способу. Следовательно, предлагаемый способ повышает точность определения ИЛ-1 моноцитов человека.

20 Положительный эффект изобретения заключается в упрощении, ускорении и повышении точности определения ИЛ вЂ” 1 моноцитов человека за счет импульсной активации моноцитов липополисахаридом и

25 использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноциты и лимфа циты).

Формула изобретения

Способ определения интерлейкина-1

30 моноцитов человека путем оценки влияния продуктов культивирования моноцитов на п ролиферативную активность Ф ГА-стимулированной культуры лимфоцитов человека, отличающийся .тем, что, с целью

35 упрощения, ускорения и повышения точности определения, моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение

40 1,5 — 3 ч, повторно промывают и вносят в лунки в обьеме 0,2 мл суспензии аутологичных лимфоцитов с фитогемагглютинином и после культивирования оценивают по сравнению с контрольными пробами индекс вос45 становления реакции бласттрансформации.

Активность ИЛ-1 ИВРБ

1730594

Ц - Ионоцигпы, акпиоирооаннь!е

_#_C импульсным иеп одо

gj- йнп7 акгпные мокоцить

7,9

7,2

7,0

0,0

0,2

75 а0

3ре,чя активации роноцил7од k C(> --"

Q- цпер цтсщгпы ионоцитЯ актиоирооанных иилуаснья меаодам

0ВРБ упернопмнпы х ионоццпоо

7,Z

7,0

0,8

g,5,5 3,0

Зрей акгп бации хоноцитоо МПС(асы)

47ие.2

Составитель П.Бонарцев

Техред М,Моргентал Корректор Н,Гунько

Редактор M.Ïåòðîâà

Пройзводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 1511 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5