Способ определения естественной киллерной активности клеток
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток Цель изобретения - упрощение способа У обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты , инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ы
С
С
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4685809/14 (22) 26.04.89 (46) 30.04.92. Бюл. N 16 (71) Киргизский государственный медицинский институт (72) В.Л.Морозов. Д.А.Адамбеков и
Д.Б. Ба ш кое в (53) 615.375(088.8) (56) Кузнецов В,А„Ившина А,В., Кадагидзе
З,Г. Иммунология, 1988, N 5, с. 27 — 30, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ КИЛЛЕPНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клийической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы.
Цель изобретения — упрощение способа.
Способ осуществляют следующим образом.
К 10 мл гепаринизиров;;нной крови из вены (25 ед/мл) добавляют 1 мл 10%-ной желатины и инкубируют 35 мин при 37 С до оседания эритроцитов. Взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколла-верографина плотностью 1,077 и центрифугируют 45 мин при 450 g, Отсасывают интерфазу (мононуклеары), дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют в полной питательной среде (ППС), состоящей из среды RPM1/1640 с добавлением
1-глютамина (300 мг/мл), 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 0,08 мг/мл гентамицина, Клетки разводят до концентрации 2 10 /мл. В пять лунок пластиковых
„„Я2„„1730592 А1 (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток.
Цель изобретения — упрощение способа. Y обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты, инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур. плоскодонных планшетов помещают по 0,1 мл взвеси клеток, B две лунки добавляют по
0,1 мл фитогепагглютинина (ФГА) в разведении 1:100 на ППС, в остальные лунки — 0,1 мл ППС. Планшеты инкубируют 48 ч при
37 С в атмосфере 5%-ного углекислого газа.
Затем планшеты центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают и отмывают клетки один раз средой 199, Во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС, клетки ресуспендируют, Культивированные клетки смешивают следующим образом.
1 (опыт), К нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные ФГАлимфоциты (бласты);
2 (контроль 1). К стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС;
3 (контроль 2), К нестимулирован н ым лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты.
Планшеты инкубируют еще 18 ч, после чего во все лунки добавляют Н-тимидин (1мкм Cu), инкубируют 4 ч, клетки переносят на фильтры и после общепринятой обрабо1730592 тки определяют уровнеь радиоактивности на бета-счетчике.
Расчет результатов проводят по формуле
1
t
1
Составитель B,Ëèòoe÷åíêo
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Бланар
Редактор М,Петрова
Заказ 1511 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,-4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
K> — О
К1 К2 где Π— число импульсов в опытной пробе;
K1 — число импульсов в пером контроле;
Кг — число импульсов во втором контроле.
Пример 1. Больной Г., 36 лет. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких, БК+.
20,03.89, Из вены больного :взято 10 мл крови, добавлено 250 ед, гепарина и 1 мл
10% íîé желатины, Кровь инкубируют 35 мин, затем взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколл-верографина и центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин, Отсасывают интерфазу, дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют клетки в полной питательной среде (ППС), Клетки разводят до концентрации 2 106/мл. В пять лунок пластикового планшета помещают по
0,1 мл взвеси клеток. В две лунки добавляют по 0,1 мл ФГА (ОИсо Р) в разведении 1;100, в остальные лунки — по 0,1 мл ППС. Планшет инкубируют 48 ч при 37 С в атмосфере 5%ного углкислого газа. Планшет отцентрифугировали. Затем клетки отмывают один раз средой 199, во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС и клетки ресуспендируют. Далее проводят смешивание клеток: к нестимулиl рованным лимфоцитам добавляют стимулированные лимфоциТы (бласты) — опыт, к стимулированным лимфоцитам добавляют
0,1 мл ППС (контроль )), к нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты (i<îíòðoëü 2). Планшет инкубируют еще 18 ч при тех же условиях.
За 4 ч до окончания инкубации во все лунки вносят 1 мкКи Н-тимидина. Ресуспендированную клеточную взвесь переносят на бумажные фильтры размером 2х2 см, Фильтры высушивают в течение 1 сут при комнатной температуре, помещают в стек5 лянный сосуд и отмывают дважды, 0,9%ным раствором хлористого натрия по 5 мин и 5%-ной трихлоруксусной кислотой в течение 1 сут при 4 С, Затем промывают еще двукратно 5%-ной трихлоруксусной кисло10 той по 5 мин и фиксируют 96-ным спиртом 2 мин, высушивают, помещают в 5 мл сцинтиллятора (PPO-РОРОP-толуол) и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном спектрофотометре (1 КВ, Швеция). Резуль15 таты регистрируют по числу импульсов в 1 мин, Получены следующие показатели: опыт — 6728; контроль 1 — 15713; контроль 2—
5127, 20 15713 — 6728
Pac e : 15713 — 5127 100 = 84,88 %, Предлагаемый способ прост, так как отпадает необходимость в постоянных пересевах клеток, как это делается в известном
25 способе поддерживания жизнеспособности опухолевых линий клеток, В связи с этим уменьшается время выполнения анализа и исключается использование полных питательных сред, что дает
30 значительный зкономический эффект.
Формула изобретения
Способ определения естественной киллерной активности клеток, включающий инкубацию лимфоцитов с мечеными
35 клетками-мишенями с последующим определением уровня радиоактивности, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве клеток-мишеней используют лимфоциты, обработанные фитоге40 магглютинином, а естественную киллерную активность определяют по уровню включения радиоактивного меченого Н-тимидина. з