Способ диагностики плоскоклеточных карцином

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуноморфологической диагностике плоскоклеточных карцином. Цель изобретения - повышение точности способа. У больного производят забор материала (ткани), из которого готовят срезы, его инкубируют в присутствии кроличьих антител против антигена, ассоциированного с плоскоклеточным раком шейки матки человека, с последующим окрашиванием и при обнаружении в срезах иммунных преципитатов диагностируют плоскоклеточную карциному. По сравнению с прототипом увеличивается точность на 22,5%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГOCYQAPCTBEHHblA KOMHTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4799598/14 (22) 30.01.90 (46) 30.01.92. Бюл, N. 4 (71) Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П,А. Герцена (72) А.И. Агеенко, E.Ñ. Иевлева, Н.В. Маршутина, Г.А, Франк и Т.Е. Гош (53) 615,374 (088.8) (56) Jos. L. Broers, М.К, Rot. T. Oostendorp et

al, — Cancer Res, 1987, v. 47, р. 3225-3234. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫХ КАРЦИНОМ

Изобретение огносится к медицине, а именно к иммуноморфологической диагностике плоскоклеточных карцином.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

С целью получения кроличьих гипериммунных антисывороток против антигена, ассоциированного с плоскоклеточным раком шейки матки человека (АРШМ), используют гомогенаты из ткани плоскоклеточного рака шейки матки человека в ЗМ KCI, рН 7,2.

Супернатант дополнительно осветляют центрифугированием при 25000 об/мин и

4 С в течение 1 ч (центрифуга Beckman, ротор SW25, США), диализуют против 0,1 м фосфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ) в течение 1 сут при 4 С. Для иммунизации кроликов используют опухолевый экстракт с полным адьювантом Фрейнда по схеме, состоящей из четырех трехдневных циклов.. Ж 1709222 А1 (57) Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуноморфологической диагностике плоскоклеточных карцином.

Цель изобретения — повышение точности способа. У больного производят забор материала (ткани), из которого готовят срезы, его инкубируют в присутствии кроличьих антител против антигена, ассоциированного с плоскоклеточным раком шейки матки человека, с последующим окрашиванием и при обнаружении в срезах иммунных преципитатов диагностируют плоскоклеточную карциному. По сравнению с прототипом увеличивается точность на 22,5 jo. введения иммуногенного материала в коньюнктиву глаза (от 0,1 до 0,4 мл соответственно 1 — 4 циклу) с перерывом в 4 дня между циклами. Спустя 56 дней животным вводят внутрикожно в 6 точек по 50 мкл указанного иммуногенного материала и через 2 ч осуществляют внутривенное введениеп 1 мл осветленного центрифугированием опухолевого экстракта беэ адьюванта Фрейнда.

Для получения антисывороток с более высоким титром антител к АРШМ проводят реиммунизацию животных через 1-1,5 мес. путем внутрикожного введения иммуногена с неполным адьювантом Фрейнда, В данном случае в качестве иммуногена использу.ют преципитат, образовавшийся в 1 -ном агаровом геле в результате реакции преципитации между истощенной лиофилизированными экстрактами из нормальных органов человека антисыворотки к АРШМ и экстрактом, полученным из ткани плоскоклеточного рака шейки матки. Кроличьи ги1709222 твор глицерина в ФСБ и просматривают в люминесцентном микроскопе Люмам. При проведении иммуноферментного метода на препараты наносят 3,3 диаминобензидин.

4 НС! 0,05 (ДАБ) и 0,017 Н20 в качестве субстрата, дают развиться коричневой окраске в течение 3-4 мин, докрашивают гематоксилином и после обезвоживания периммунные антисыворотки истощают дробными порциями лиофилизированных экстрактов из нормальных тканей дробными порциями лиофилизированных экстрактов из нормальных тканей человека для удаления тканевоспецифических антител.

Поликлональные антитела к АРШМ из абсорбированной антисыворотки к АРШМ выделяют с по1чощью сорбента, представленного иммобилизованным на ВгСЙ-сефарозе-4В экстрактом из плоскокпеточного рака шейки матки. Антитела элюируют с колонки НОглициновым буфером, рН 2,8, диализуют против ФСБ в течение ночи при 4 С и концентрируют 10 раз в диапизном мешочке, помещенном в поли зтилен гликол ь-40000, разливают по 0,2 мл с добавлением азида

Na и 1 -ного бычьего сывороточного альбумина и 50 глицерина, хранят при -20 С до использования.

Иммуногистохимическое изучение проводят на парафиновых срезах толщиной

5 мкн (микротом МПС-2). Срезы депарафинируют по обычной методике, проводя через батарею ксилолспирты понижающейся концентрации„затем отмывают в трех сменах ФСБ по 3 мин. На срезы наносят кроличьи поликлональные антитела (1;8), разведенные в 17,-ном бычьем сывороточном альбумине, и инкубируют 30 мин при

37 С, затем отмывают в ФСБ 3 раза по 3 мин и наносят либо бараньи антикроличьи глобулины, меченные изотиоционатом флюоресцеина в разведении 1:16 (производство лаборатории люминесцирующих сывороток

ИЗЫ им. Н.Ф. Гамалеи), либо антитела козы против глобулинав кролика, меченные пероксидазой хрена (ИЗМ им Н,Ф. Гамалеи) в разведении 1:80 (соответственно при проведении иммунофлюоресцентного или иммунопероксидазного метода), При проведении иммунопероксидазной реакции необходимо нейтрализовать эндогенную пероксидазу. После 30 минутной инкубации вторичных антител, срезы отмывают в ФСБ 3 раза по 3 мин, Препараты, изучаемые с помощью иммунофлюоресцентного метода, заключают,. в 50%-ный распрепаратов их заключают в канадский бальзам.

Пример. Больная Крылова Л.И., 42 года. Исследовался опухолевый материал, полученный со слизистой шейки матки. На иммуноморфологическом препарате положительная реакция выявлялась в виде интенсивного коричневого окрашивания в группах клеток, подвергшихся ороговению, в участках, менее дифференцированных реакция — менее интенсивная. Окончательное гистологическое заключение Д-36732; плоскоклеточный ороговевающий рак шейки матки, умеренно дифференцированный.

Анализ сравнительных данных с прототипом показывает высокую специфичность антител к АРШМ (по прототипу точность составляет 50,7%, а в предлагаемом способе

73,2, т.е. увеличение точности составляет

22,5%), что позволяет сделать вывод о более высокой точности предлагаемого метода

J дифференциальной диагностики, а также отмечается возможность использования его при ретроспективном анализе сложных случаев.

Формула изобретения

Способ диагностики ппоскоклеточных карцином, включающий забор материала, фиксацию его, приготовление гистологического среза, инкубацию в присутствии антител с последующим окрашиванием и при выявлении иммунных преципитатов на срезе диагносцируют плоскоклеточную карциному, отличающийся тем,что,сцелью повышения точности способа, инкубацию среза осуществляют в присутствии кроличьих антител против антигена, ассоциированного с плоскоклеточным раком шейки матки человека.

Составитель В. Литовченко

Редактор Ю. Середа Texpep„ MÌîðãeHòà1l Корректор Н. Ревская

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 422 Тираж Подписное

BHVlVnM Государс венного комитета по изобре м открытиям при r KHT ССО

113035, Москва, Ж-35„Раушская наб„4/5