Способ определения антител к ликопротеидам низкой плотности в крови

 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике . Цель изобретения заключается в разработке способа определения антител к липопротеидам низкой плотности в крови. Твердую фазу обрабатывают раствором, содержащим Ю мкг/мл липопротеидов низкой плотности и 0,02 К Nad, pH 8,0, при 36°С в течение 2 ч с дальнейшим выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч с последующи проведением стадий твердофазного иммуноферментного анализа, которые включают добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывку твердой фазы, нанесение на нее конъюгата пероксидазы с антителами к иммуноглобулину П человека, повторную отмывку, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксидазной реакции и расчет содержания антител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой.Разработанный способ позволяет определить минимальную концентрацию антител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови человека, равную 15,6 нг/мл. (Л

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ1ЬЛИН

Щ) 5 С 01 N ЗЗ/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4675352/14 (22) 06 .04.89 (46) 15.01.92. Бюп. Р 2 (71) Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра АМН СССР (72) Г.А.Ермолин, М.К.Диков, В.Н.Хлыстов, Н.В,Канская и P.Ñ.Êàðïîâ (5З) 621.015 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ЛИПОПРОТЕИДАК НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ В

КРОВИ (57) Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике. Цель изобретения заключается в разработке способа определения антител к липопротеидам низкой плотности в крови. Твердую фазу обрабатывают

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике °

Целью изобретения является определение антител к липопротеидам низкой плотности (JIIIXII) в сыворотке крови человека.

Сенсибилизация планшетов. В лунки

96-луночных полистироловых планшетов с плоским дном заливают 0,1 мл раствора, содержащего 1О мкг/мп ЛПН11, 0,02 M Na(;1 рН 8,0 (наслаивающий раствор). 11ланшеты закрывают крышкао, ми и инкубируют при 36 С 2 ч и при

4 С 15-18 ч, По окончании инкубации

„.эо„„ уа57 у А1

2 раствором, содержащим 1О мкг/мл липопротеидов низкой плотности и 0,02 К

NaC1, рН 8,0, при 36 С в течение 2 ч с дальнейшим выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч с последующим про- . ведением стадий твердофаэного имм — ноферментного анализа, которые включают добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывку твердой фазы, нанесение на нее конъюгата пероксидазы с антителами к им" муноглобулину Г. человека, повторную отмывку, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксндазной реакции и расчет содержания аптител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой. Разработанный способ позволяет определить минималь=

1 ную концентрацию антител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови человека, равную 15,6 нг/мп. раствор JIIIHH удаляют и лунки трижды промывают 0,057,-ным раствором твина

20 1-2 мин и водопроводной водой.

Подготовка калибровочного материала. Разведения калибровочного материала, кратные двум, готовят на

0,01 Х растворе фасфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ) с 0,05Х-ным раствором твина 20. Готовят смесь разведений от 1 мкг/мл до 15,6 нг/мл иэ донорских сывороток.

Внесение исследуемого и калибровочного материала. Калибровочный ма- териал вносят в лунки в объеме 0,1 мл.

1705747

Исследуемые образцы плазмы или сыворотки крови вносят по 0,1 мл при разведении 1:100 н <ьСУ, содержащем 0,05/ твина-20. После внесения

5 материала планшеты закрывают крышками и инкубируют н термостате 3 ч при о

52 С. Содержимое лунок удаляют, планшет промывают струей нодопронодной воды, затем на 1-2 мин заполняют 0,05/ lp твин-20 и вновь ополаскивают водопроводной водой. Процедуру отмывки планшета повторяют трижды.

Внесение конъюгата. В каждую лунку вносят по О, 1 мл разведенного раствора конъюгата пероксидазы с антителами к иммуноглобулинам (человека и инк— бируют 1 ч при 36 С. Отмывку планшета о, проводят аналогично описанной.

Внесение субстратной смеси и оста- 20 нонка ферментативной реакции. На 1 планшет готовят смесь, содержащую

5 мг ортофенилендиамина, 15 0,05 М цитратного буфера, рН 7,4 и 10 мкл раствора гидролерита. Субстратную смесь вносят н каждую лунку в объеме (1,1 мл и инкубируит н темноте пр,( комнатной температуре 10-15 мин. Остановку реакции проводят внесением в лунку по 50 мкл 25/-ной серной кислоты, после чего планшет встряхивают.

Регистрация результатов. Регистрацию результатов проводят с использованием фотометра с вертикальным ходом луча при длине волны 492 нм или визу35 ально.

При инструментальной регистрации на миллиметровой бумаге строят калибровочную кривую зависимости поглощения от концентрации антител к ЛПНП.

Для определения концентрации антител к ЛПНП в образце сыворотки на горизонтальной оси находят точку, соответствую((ую величине поглощения ее ферментатинной реакции (среднее значение двух лунок) и результат умножают на 100 (скрининг-титр изучаемого образца сыворотки).

Апробация метода проведена на пуле донорских сывороток крови (не менее

10(l0 образцов) °

Минимально определяемая концентрация аутоантител к !IIIHII 15,6 нг/мл сыворотки крови человека.

Пример 1. При изменении концентрации Na(;1 в наслаивающем раство55 ре до 0 01 и О, (.(It рН 8 0 проис ходит снижение количества иммобилизированных 1!!1НП, на 19 и 2Г/ соответственно определенное по количеству связываемых антител к JtIIHII.

Пример 2, При изменении рН среды наслинающего раствора до 7,0 и 9,0 происходит снижение количества иммобилизированных Л11НП на 27 и 35/ соответственно.

Пример 3. При изменении времени инкубации планшетов с 2 ч до

1 и 3 ч при 38 +1 (; (последующая ино кубация при 4 С общепринята) происо, ходит снижение количества иммобилизированных ЛПНП на 46 и 23/, соответственно.

Пример 4. При изменении концентрации наслаинаемых JIIIHII до Ч и

11 мкг/мл происходит снижение количества иммобилизированных .11ПНП на 7 и

9/ соответственно.

Пример 5. При инкубации tltHH о,, о, в лунках планшета при 34 С и 38 С количество антител к ЛПНП было определено равным 12,3 кг/мл и 11,8 кг/Мл соответственно. Режим инкубации лри о

36 С позволил определить количество антител, равное 15,6 кг/мл.

Таким образом найденный режим сорбции ЛПНП на твердой фазе позволяет проводить количественное определение антител к ЛПНП с помощью иммуноферментного анализа. формула и э о б р е т е н и я

Способ определения антител к липопротеидам низкой плотности и крови путем обработки твердой фазы раствором, содержащим 10 мкг/мл лилопротеидов низкой плотности и (t,(2 M

Na(;1, рН 8,0 при Зо С н течение 2 ч с дальнейшим выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч и проведения последующих стадий тнердофаэного иммуноферментного анализа, включающий добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывание твердой фазы, нанесение на нее конъю гата пероксидазы с антителами к иммуноглоблину Г человека, повторное отмывание, нанесение хромогенной су6стратной смеси, остановку пероксидаэной реакции и расчет содержания антител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой.