Способ идентификации т-хелперов и т-супрессоров

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано дляидентификации Т-хелперов и Т-супрессоров при оценке имунного статуса организма в норме и при патологии. Целью изобретения является ускорение и повышение точности. Способ осуществляется путем обработки лимфоцитов параллельно теофиллином и колхицином в конечной концентрации 3-7 мкг/мл. инкубац.ии, отмывания с последующей обработкой проб раствором акридинового оранжевого в разведении 1:30000. Учет количества Т-хелперов и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции и при активации лимфоцитов колхи1|;ином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллионом - Т-супрессоры. Способ позволяет оценить физиологическую активность субпопуляций Т-лимфоцитов хелперов. супрессоров по активности дезоксирибонуклеопротеидного комплекса. 3 табл.с/>& С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (s1)s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К аатОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4710677/14 (22) 26.06,89 (46) 30.01.92. Бюл. М 4 . (71) Киевский медицинский институт им. акад A.À. Богомольца .P2JE.Г. Гаркавэя. В.Д. Дышловой, С.В. Янушевич, И.В. Данова и В.Г. Бордонос (53) 615.375 (088.8) (56) Ярилин А.А. Чувствительность Т-лимфоцитов человека к теофиллину. Биологическая и клиническая интерпретация.

Клеточные факторы регуляции иммуногенеза, Наука, Новосибирск, 1985, с. 24-39. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ Т-ХЕЛПЕРОВ И Т-СУПРЕССОРОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано для

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано в клинической и лабораторной практике для . идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что пробы лимфоцитов параллельно обрабатывают теофиллином и колхицином в конечной концентрации 3 мкг/мл — 7 мкг/мл, после инкубации и отмывания к пробам приливают раствор акридинового оранжевого в разведении

1:30000 и учетом количества Т-хелперов идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров при оценке имунного статуса организма в норме и при патологии. Целью изобретения является ускорение и повышение точности.

Способ осуществляется путем обработки лимфоцитов параллельно теофиллином и колхицином в конечной концентрации

3 — 7 мкг/мл, инкубэции, отмывания с последующей обработкой проб раствором акридинового оранжевого в разведении 1:30000.

Учет количества Т-хел перов и Т-супрессороа ведут по интенсивности флюоресценции и при активации лимфоцитов колхицином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллионом—

Т-супрессоры. Способ позволяет оценить физиологическую активность субпопуля- 3 ций Т-лимфоцитов хелперов, супрессоров по активности дезоксирибонуклеопротеид- . ного комплекса. 3 табл, и Т=супрессоров ведут по интенсивности, С флюоресценции проб и при активации, Ч.) .лимфоцитов колхицином определяют Т- Я хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллином — Т-суп рессоры.

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты в равных количествах перед инкубацией с акридиновым оранжевым ,обрабатывают следующим образом. Одна проба лимфоцитов служит контролем, другую пробу обрабатывают теофиллином, а третью пробу колхицином в конечной концентрации 3 мкг/мл-7 мкг/мл, После инкубации при 37 С и 45 мин пробы отмывают, добавляют экридиновый оранжевый, инкубируют при 4 С 30 мин, после чего центрифугируют и на спектрофлюориметре при А 530 нм (А возбуждения 460 нм) измеряют интенсивность флюоресценции надосадочной жидкости. Количество 5

Т-хелперов и Т-супрессоров определяют по формуле

Тх 100 - 30, 5 — 4

Гс = 100 - 20 .

Пример 2. Все операции с лимфоцитами донора ЬЬ 2 осуществляют аналогично примеру 1.

По формуле вычисляют Т-хелперов и

Т-суп рессоров где А» — количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами, контроль;

Ас — количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их теофиллином;

Ах количество акридинового оранже- 20 вого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их колхицином.

Конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. Из исследуемой крови донора М 1 выделяют на фиколл-уротрасте лимфоциты, которые в равных количествах вносят в 3 пробирки. Лимфоциты первой пробы служат контролем, к ним приливают

2 мл физиологического раствора. Лимфо- 30 циты второй пробы обрабатывают теофиллином, лимфоциты TpeTb8A пробы — колхицином, в конечной концентрации 3 мкгl мл — 7 мкг/мл.

Оптимальной дозой колхицина является концентрация 4 мкг/мл. Общий объем каж- 35 дой пообы доводят до 2 мл физиологическим раствором, После инкубации проб при

37 С в течение 45 мин лимфоциты отмывают от реагентов при 1500 об/мин в течение

10 мин и к лимфоцитам в первоначальном объеме 2 мл приливают 2 мл раствора акридинового оранжевого. Пробы инкубируют

30 мин при 4 С, затем центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют интенСивность флюоресценции в контрольной и опытных пробах. Разность величин флюоресценции раствора акридинового оранжевого и контрольной пробы, а также опытных проб дает представление о количестве связавшегося акридинового оранжевого.

По формуле вычисляют количество

Т-хелперов и Т-супрессоров

Тх = 7 100 -35,7$;

7 — 6

Тс 7 100% 14,4

В работе было обследовано 14 доноров.

Результаты, полученные предлагаемым способом, сравнивали с результатами, пол- ученными методами теофиллиновых розеток и с помощью моноклональных антител (фирма "Couetcr", США).

Результаты представлены в табл,3.

Таким образом, результаты, полученные предлагаемым методом, приближаются к результатам, которые были получены методом моноклональных антител, так как между ними не было достоверных различий.

Не было достоверных различий и в количестве Т-супрессоров, определенных методом теофиллиновых РОК. Однако в количестве

Т-хелперов такие различия имели место (р< 0,01), что указывает на повышение точности результатов.

Формула изобретения

Способ идентификации Т-хелперов и

Т-супрессоров, включающий обработку лимфоцитов теофиллином путем инкубации, отмывания с последующим учетом количества Т-хелперов и Т-супрессоров, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, параллельно пробу лимфоцитов обрабатывают колхицином в конечной концентрации

3 мкг/мл — 7 мкг/мл, затем раствором акридинового оранжевого в разведении

1:30000 и учет количества Т-хелперов и

Т-супрессорое ведут по интенсивности флюоресценции. и при активации лимфоцитов колхицином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллином — Т-супрессоры.

1709221

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

* Различия достоверные (р < 0,01).

Составитель Б.Мануйлов

Редактор Ю. Середа Техред ММоргентал Корректор H. Ревская

Заказ 422 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101