N-незащищенный 5 @ -о-диметрокситритилдезоксинуклеозид-3 @ - н-фосфонат в качестве мономера в синтезе олигонуклеотидов н- фосфонатным методом

 

Изобретение относится к химии нуклеотидов, в частности к N-незащищенному 51-0- диметокситритилдезоксинуклеоэид-3 -Н-фосфонату ф-лы где В - аденозин, гуанозин или цитидин, который используют в качестве мономера в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом. Цель - выявление соединений, обладающих полезными.свойствами. Получение ведут обработкой соответствующих незащищенных нуклеозидов диметокситрилилхлоридом с последующим взаимодействием с салицилхлорфосфитом и выделением обращенно-фазовой хроматографией. 2 табл. ел С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (м)э С 07 Н 19/10

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ сн,о о с-осн снбо(0 -с -Oc 2 (21) 4784124/04 (22) 18.01.90 (46) 15.01.92. Бюл. N 2 (71) Новосибирский институт биоорганической химии CO АН СССР (72) А.С.Левина, Д.P.Òàáaòaäçå и Н.И.Комарова (53) 547.961. 1 (088,8) (56) Froehler В,С., Matteuccl М.D. — Tetr.

Letters, 1986, ч. 27, Рв 4, р. 469-472.

Froehler В,С., Ng P.G., Matteuccl М.D„Nucl. AcIds Res., 1986, ч 14, N 13, р. 5399-5407.

Garegg P.l.. Regberg Т., Stavlnskl J., Stromberg R.— Tetr. Letters, 1986, ч. 27. %34, р. 4055-4058.

Garegg P.j,. Ве9Ьег9 Т., Stavinskl .1

S1romberg R..— Chem. Scripta, 1986, ч. 26, р.59-62.

Биоорган. химия, т. 14, N. 4, с. 484-489.

Т1 G.S., Ga ffney В.б., Jones R.À., J. Amer.

Chem. Soc., 1982, ч. 104, о. 1316-1319. (54) N-НЕЗАЩИЩЕННЫЙ 5 -0-ДИМЕТОКСИТРИТИЛДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД-3 -НФОСФОНАТ В КАЧЕСТВЕ МОНОМЕРА В

Изобретение относится к области биоорганической химии. а именно к новым химическим соединениям N-5 -0-диметок1 ситритильным производным дезоксинуклеоэидов общей формулы I осн, о оО Р-Н где  — аденозин, гуанозин, цитидин, которые могут быть использованы как исходные мономеры для синтеза олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом.

В качестве мономеров для Н-фосфонатного метода синтеза олигодеэоксинуклеоэиЯ2 1705299 А1

СИНТЕЗЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ k-ФОСФОНАТНЫМ МЕТОДОМ (57) Изобретение относится к химии нуклеотидов, в частности к N-незащищенному 51

Ю диметокситритилдезоксинуклеоэид-3 -Н

-фосфонату ф-лы сн,о о

О Р-О

I н где  — аденоэин, гуаноэин или цитидин, который используют в качестве мономера в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным ,методом. Цель — выявление соединений, обладающих полезными, свойствами. Получение ведут обработкой соответствующих незащищенных нуклеоэидов диметокситрилилхлоридом с последующим взаимодействием с салицилхлорфосфитом и выделением обращенно-фазовой хроматографией. 2 табл. дов обычно используют N-ацилированные

5 -0-диметокситритилдезоксинуклеоэид-31 /

-Н-фосфонаты (1-5) формулы I I о

О Р-ОЙ где  — N — бенэоиладенозин, N — бензо. м 6 4 илцитидин, N — иэобутирилгуанозин.

Данные соединения являются аналогами описываемых как по структуре, так и по назначению. Получение из них олигонуклеотидов включает следующие стадии:

1705299 с 1.ч н7 cpOs, 2 II,PlvC< н (г, 1т и - ч, — ---Ри

2,С СС

Q э е -,н т н„ооон, о

11

1 ." оо

° 1,Н н, - и — -2.1 н о о е в нч орони- с о ! о- о н, Я

2 н,о сч„,осо...н, нн о

П-Н вЂ” фосфонатный мономер (DMT)N++p, П вЂ” полимерный носи ель;

Фо

Pi ч CI — пи вал оилхлорид, (СНз)зСС,, м х С6

N — N — ацил дезоксинуклеозид.

Средний выход на каждой стадии присоединения одного звена > 957(,, Недостатком известных мономеров яв- 20 ляется то, что при их использовании для синтеза олигонуклеотидов целевые продукты получают после жесткой обработки аммиаком (в течение 16 ч при 50С), необходимой для удаления обычно исполь- 25 зуемых N-защитных ацильных групп. Это приводит к значительному увеличению длительности процесса и может быть нежелательно при синтезе олигонуклеотидов с чувствительными к жесткой аммиачной об- 30 работке модифицированными межнуклеотидными группами.

Цель изобретения — получение новых мономеров, использование которых для синтеза олигонуклеотидов существенно ус- 35 коряет и упрощает процесс получения последних при сохранении выхода целевых продуктов, Поставленная цель достигается применением новых химических соединений — 51

-0- диметокситритилдезоксинуклеоэид-3 -Н- 40

-фосфонатов формулы 1, которые получают обработкой соответствующих незащищенных нуклеозидов диметокситритилхлоридом с последующим взаимодействием с салицилхлорфосфитом и выделением обра- 45 щен но-фа эоеой хроматографией.

Полученные соединения были испытаны в качестве мономерое для получения олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом в ручном варианте. Испытания проводили в 50

1 сравнении с известными мономерами — 5-О-.диметокситритил-N-ацилдеэоксинуклеоэид-3 -Н-фосфонатами формулы II, 1

Результаты испытания подтверждают воэможность синтеза олигонуклеотидов из 55 целевых мономеров, при этом сохраняется выход целевых продуктов (средний выход на стадию > 957ь), исключается иэ процесса дли1ельная по времени стадия жесткой аммиачной обработки. Кроме того, упрощаетcR процесс пслуче ия исходных мономерое, поскольку иск ю аегся стадия ацилироваНИЯ З ЗОЦИ ЛИ., Cvi X РУПП НУКЛЕОЗИДОВ.

П р и м е I:, Синтез 5 -0-диметоксит1 ритивци1идин-3 -Н-фосфоната.

1 а Синтез 5 -д-диметокситритилцитидина, (ОМТ)С, 1 ммоль ц1 и. лна(228 мг) растворяют в

10 Мп абс. п лри*. а, добавляют 1,5 ммоль (125 мкл) метилимь,дазола (Mefm) и 2 ммоль (680 мг) димето ситритилхлорида (DMTCI), Через 4 ч добаеляк т дополнительное количество DMTCI u Ме)п (1 и 0,75 ммоль соответственно). 3a одом реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (TCX) e системе хлороформ-этанол (8,5:1,5).

Через 15 ч реакционную смесь после добавления 1 мл этанола упариеают до масла, раствсряют в 10 мл хлороформа и экстрагируют насыщенным раствором йаНСОз(2х10 мл). Хлороформныи слой высушивают над безводным NazSO4, упаривают и хроматографируют на силикагеле (колонка 200 мл, градиент этанола (О-15$) в хлороформе,содержащем 0,2 триэтиламина). Фракцию, содержащую продукт — (DMT)C, упаривают и осаждают из хлороформа в гексан. Выход

292 мг (535 мкмоль); 47,5 (», Продукт гомогенен по данным ТСХ и микроколоноч,ой обращенно-фазовой хроматографии.

УФ(СрН ОН)Л,п х = 234, 275 нм; min

223, 259 нм;

ПМР(СОзЯОС0з): д= 7,6(4. 35,6=8Н, 1, Не). 7,4-7,1 (m, 9, Аг); 6,9-6,7 (m, 4, Аг); 6,11 (t, J =7Hz. 1, Н1):5,05(4, Jg,е 8 Hz, 1, Hg): 4,22 (m, 1, Нз); 3,87 (m, 1, Н4); 3,67 (S, 6, ОСНз):

3.4-3,2 (m, 2, Н5,5.7; 2,2-1,9 (m, 2, Н,г }.

Данные УФ и ПМР согласуются с литературными данными. б. Синтез 5 -0-диметокситритилцити1 дин-3 -Н-фосфоната, (DMT) Ср.

220 мкмоль (118 мг) (MT)C, полученного, как описано выше, высушивают в вакууме над Р205 и растворяют в 0,5 мл абс. диоксана; затем к раствору добавляют 200 мкл метилморфолина и 0,45 мл 1М раствора салицилхлорфосфите (SalPCI) в диоксане (450 мкмоль) Через 10-15 мин полноту реакции проверяют с помощью TCX (система хлороформ-этанол 8,5;1.5) и анализируют обращенно-фазоеой хроматографией. Продукт выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке с Sllasorb С-8 в градиенте ацетонитрила в воде (5-807ь).

Фракцию, содержащую продукт — (0МТ)Ср, упариеают, высушивают упариванием с абс. ацетонитрилом и осаждают в гексан.

Выход 126 мг (181 мкмоль), 82 (,.

1705299

Продукт гомогенен по данным ТСХ, MKX u P-ЯМР.

УФ(С Н50Н): Лгпах = 245 и 275 нм;

Л, = 224 и 259 нм.

Р-ЯМР (пиридин): д = 1,69 м,A„Jp н - 5

609 Hz.

П р и M е р 2, Синтез 5 -0-диметоксит1 ритиладенозин-3 -Н-фосфоната.

1 а. Синтез 5 -0-диметокситритиладенозина, (ОМТ) А, 10

Методика синтеза (ОМТ)А полностью аналогична таковой для (ОМТ)С, К 1 ммоль аденозина(251 мг) в 10мл абс, пиридина добавляют 2 ммоль (670мг) DMTCI и 1,5 ммоль(125 мкл) Melm. Через 4 ч допол- 15 кительно добавляют 1 ммоль (335 мг) ÎMTCI и 0,75 ммоль (60 мкл) Melm.

Выход (DMT)A 337 мг (605 ммоль), 60,5 .

Продукт гомогенен по данным TCX и 20 микроколоночной обращенно-фаэовой хроматографии.

УФ (С2H50H); Л щах 236 и 262 Ht4, Л м - 225 и 253 нм.

ПМР(СОС!з): д =8.22(s, 1, Нв); 7,95(з . 25

1, Hz); 7,4-7,0 (m, 9, Ar); 6,82-6,66 (m, 4Н, Ar), 6,41 (t. J - 7Hz, 1, Н 1); 6,17 (brs, 2, NHz); 4,66 (m, 1, Нз); 4,16 (m. 1, Н4), 3,73 (3, 6, ОСНз):

3,36 (m, 2, Н5 5 ); $,1-2,3 (m, 2, H2 Я. б. Синтез 5 -0- диметокситритиладено30 зин-3 -Н-фосфоната — (ОМТ)Ар .

Синтез (DMT)Ap проводят аналогично (DMT)Cp.

К 220 мкмоль (130 мг) (ОМТ)А в 0,5 мл абс. диоксана добавляют 200 мкл метилморфолина и 0,44 мл 1М раствора SaIPCI в абс.. диоксане (440 мкмоль).

Продукт гомогенен по данным ТСХ, MKX и з рЯМР

Выход (DMT)Ap 128 мг (178 мкмоль), 40

81 .

УФ(С2Н5ОН): Л max 236,5 и 260 нм;

Л ть - 225 и 253 нм:з P-RM p . (пиридин): d =

2,40 м.д., Лр-н = 609 Hz.

Пример 3. Синтез 5 -0-диметоксит1 45 ритилгуанозин-3 -Н-фосфоната, 1 а. Синтез 5 -0-диметокситритилгуано1 зина (DMT)G.

1 ммоль гуанозина (267 мл) суспендируют в 30 мл абс. пиридина и добавляют 3 ммоль Mefm (250 мкл) и 3 ммоль DMTCI (1 г).

Через 3 ч дополнительно добавляют 2 ммоль DMTCI (670 мл) и 2 ммоль Melm (165 мкл), Через 15 мин реакционная смесь становится прозрачной и реакция практически заканчивается: анализ с помощью ТСХ в системе хлороформ-этанол (8,5:1,5) показывает практически полное отсутствие исходного нуклеоэида.

Дальнейшую обработку реакционной смеси проводят, как описано выше для (ОМТ)А и (ОМТ)С, Выход (DMT)G 308 мг (545 мкмоль), 54.5, Продукт гомогенен по данным микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии и ТСХ.

УФ(СгН5ОН): Лл „- 237 нм. плечи на

260 и 275 нм; Л ь - 222 нм.

ПМР (CDCI3): d = 7,85 (з, 1, He); 7.4-7.0 (m, 13, Ar, CHClg): 6,7-6,6 (m, 5, Ar, Н1); 5,7 (brs, 2, ИНг); 4,46 (m 1, Нз); 3,98 (m, 1, Н4)1

3.64 (s. 6, ОСНз); 3,06 (m, 2. H5,5-); 225-2,0 (m. 2, H2,2-).

ПМР(СОз5ОСОз)6= 8,14 (s. 1, Нв); 7,256,9 (m, 9, Аг); 6,85-6.60 (m, 4, Ar); 6,35 (brs, 2, М Н2); 6,05 (t, J - 7Hz, 1, Н 1); 4,3-3,7 (m, 2, Н4, Нз); 3.62 (s, 6, ОСНз); 2,27 (m, 2, Н5,5"), 1,15-0,89 (m, 1, 4,zg. б, Синтез 5 -0-диметокситритилгуанозин-3 -Н-фосфоната. (DMT)GP.

Синтез (ОМТ)бр проводят аналогично синтезу (МТ)Ар и (DMT)Gp.

К раствору 130 мкмоль (75 мг) (DMT)C в

0,5 мл абс. диоксана добавляют 100 мкл метилморфолина и 0,25 мл 1М раствора

SalP CI в абс. диоксане.

Продукт, выделенный обращенно-фаэовой хроматографией, по данным з р-ЯМр содержит неидентифицированные примеси (до 107ь).

Выход (ОМТ)Г р 56 .

УФ(СрН5ОН): 4 msx = 236 нм. плечи на

260 и 275 нм; Л ъ -224,5 нм.

:з р-RMP (пиридин). д = 1,20 м,д.. Jp- 613 Н; примесь: д = 5,69 м.д.

Пример 4. Синтез олигонуклеотидов с использованием структурных аналогов—

N-ацилированных Н-фосфонатных синМнов (П).

Для синтеза использовали синтоны (DMT)Tp, (DMT)bzAp. (0MT)bzC, (OMT)IbuGp. где Т вЂ” тимидин; G — гуаноэин; bz — бензоил;

С вЂ” цитидин, А — аденозин,lbu-изобутирил.

Синтез проводят на колонке со стеклянным фильтром в ручном варианте. Используют 5-10 мг полимера CPG-500 с присоединенным за 3 -ОН группу (DMT)T в

l количестве 40-60 мкмольlг.

Цикл присоединения одного нуклеотидного звена проводят согласно табл, 1, После проведения нужного числа циклов удаляют ДМТ-группу с 5 -концевого

1 звена (1ь СрзСООН в хлористом метилене, 40с), окисляют межнуклеотидные Н-фосфонатные группы до фосфатных (0,2 М Лг в смеси пиридин-вода, 98:2, 20 мин), удаляют нуклеотидный материал с полимера и удаля1705299

Таблица 1 ют защитные N-ацильные группы (конц. аммиак. 1бч, 50"С).

Олигонуклеотиды выделяют ионообменной и обращенно-фаэовой хроматографией. С испольаоеанием мономеров формулы II синтезируют следующие олигонуклеотиды; ААААТ, ССССТ, GCAGT, TATTTGGСТ.

Выходы на стадии, оцененные по поглощению DMT -катиона, > 95%.

Выход пентануклеотидэ GCAGT, определенный из профиля ионообменной хроматографии как отношение оптического поглощения продукта к общему поглощению нуклеотидного материала, 34ф>.

Полученные олигонуклеотиды анализируют по УФ-спектрам, а также после ферментативного гидролиза с помощью микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии.

Результаты приведены в табл. 2.

Пример 5. Синтез олигонуклеотидов с использованием целевых N-незащищенных Н-фосфонатных синтонов (I).

Для синтеза используют синтоны: (DMT)C0 (DMT)Ap. (0МТ)бр, а также обычно используемый (ОМТ)Тр. Синтез проводят аналогично описанному в примере 4 за исключением того. что в качестве растворителя для реагентов и для промывки используют пиридин. Кроме того, для растворения мономера(ОМТ)Ср в пиридине необходимо добавлять 1-2 $ этилдиизопропиламина.

Цикл присоединения одного авена проводят согласно табл. 2 с добавлением стадии промывки полимера ацетонитрилом до и после деблокирования.

После окончания синтеза проводят обработку, как описано в примере 4 (удаление

5 -DMT-группы, окисление). Удаление нчк1 лвотидного материала с полимера проводят обработкой концентрированным аммиаком при комнатной температуре в те+ Растворители абсолютированные чение 1 ч Олигонуклеотиды выделяют ионообменной и обращенно-фазовой хроматографией. С использованием целевых мономеров формулы! синтезируют следую5 щие олигонуклеотиды; ААААТ, ССССТ, GCAGT, TATTTGGCT.

Выходы на стадии, оцененные по DMTкатиону, > 95 .

Выход пентануклеотида GCAGT. onpe10 деленный,как описано в примере 4, 29 .

Полученные олигонуклеотиды анализируют, как указано в примере 4.

Данные приведены а табл. 2.

Как видно из табл. 2. олигонуклеотиды, 15 синтезированные из структурных аналогов

N-ацилированных Н-фосфонатных синтонов (ll) и из целевых N-незащищенных мономеров (!), практически не отличаются по

УФ-спектральным характеристикам. а так20 же по данным обращенно-фазовой хроматографии ферментативного гидролиэата этих олигонуклеотидов. Полученные резуль- таты свидетельствуют о том, что при использовании предложенных мономеров в

25 Н-фосфонатном методе экэоциклические аминогруппы не модифицируются и олигонуклеотиды, полученные иэ этих мономеров, идентичны полученным иэ обычно используемых Н-фосфонатных синтонов.

30 Формула изобретения

N-Незащищенный 5 -О-диметоксит-.

1 ритилдеэоксинуклеозид-3 -Н-фосфойат общей формулы !

СН О

35 Ф

СНэ0©-с-ОСНОВ ф у о

0 Р-0

40 где  — аденозин, гуанозин или цитидин, в качестве мономера в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом.

1705299 таблмца2

Ланмые обраценно-фа?овод мнкроколоночнод хроматографии гищюлмэатов олигомуклеотидов (Ф03 II

5-муклеотидаэа вэ яда кобры) (PHT)acy1 IIp (используемые мономеры) асуl Н

Данные УФ-спектров

ПриОлмгонуклеот ид мер ртвз

0160

ы?Эо

0rco

0 ?го

0 х mOI я ят н молярные соотновемня нуклеотндов

В?С

Bzh! 1,0 1,0

2,0

G,С,Л

2 0

1 l,0

1,0

ibuG, bzh, bzC

0,85 0,93 О, 68

0,61 0,97 0,74 гбг,5 233

263,0 232

2,1

5,0 0,7

5,0 0,7

Т, Л, С, С

2,3

Т,b?A, Ь?С, ibuG

Время удеркивання лри хроматографии для цитидима (2,7-2 ° 6 мнм, гуаноэина (5,5-5,6 мнн), тимндина (6, 0-6, 1 мнн), аденознма (1 1 ° 0-1 1, 2 мин) не зависит от типа используемых мономеров лрм синтезе олигонуклеотидов и соответствует вренени удермивания для маркеров (С - 2,75 мин, С вЂ” 5,5 ннн, Т - 6,0 нин, А - 10,9 мин) Составитель И. Федосеева

Редактор Л. Веселовская Техред М.Моргентал Ко ектор 0. Кравцова рр р

Тираж Подписное

Заказ 168 б етениям и открытиям при ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и отк ы

113035. Москва,Ж-35, Раушская наб.. 4/5 т "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина,,1 1

Производственно-издательский комбинат

lа ССССТ

16, CCCT г а ллллт

26 AAAAT

3а GCAGT

36 СОСТ

4а TATTKGCT

46 ТЛТ1СССТ

0 ° 64 1, 10 082

0,84 1 ° 14 0,86

0,83 0,69 0,31

0,63 0,70 0,30

0,93 0,86 0,57

0,93 0,86 0,57

267 247

267 247

259 232

259 232

258 229

258 229