Способ получения меченных тритием дезокси-(5,6- @ н @ )- цитидин-5 @ -моно-, -дии трифосфатов

 

Изобретение относится к химии меченных тритием дезокси1у тидиннуклеотидов, в частности к дезокси-

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19 пи 3!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 07. 07. 90. Бюл. Ф. 25 (21) 3939486/31-04 (22) 20.06 ° 85 (71) Институт молекулярной генетики

АН СССР (72) М.Д,Франк-Каменецкая и Н.Ф,Мясоедов (53) 547 . 963. 32 26 . 07 (088 .8) (56) Радиохимия, !980,22, !! 4, 579-584..(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТНЕМ ДЕЗОКГИ-(5, 6- Н ) -ЦИТИЛИН-5 —

МОНО- -ЛИ- И ТРИФОСФАТОБ (57) Изобретение относится к химии меченных тритием дезоксицитидиннуклеотидов, в частности к дезокси(5,6- Hg)-цитндин-5 -моно-(МФ), 3

-ди- (ДФ) и трифосфатом (ТФ), обладающим молекулярной радиоактивностью и используемым в биохимии, молекулярной биологии, генетике и экспериментальной медицине. Для выявления более высокой молекулярной радиоактивности у соединениГг указанного (51)5 С 07 В 59 00 С 07 Н!9 10 класса получены новые замещенные фосфаты новым способом. Последний ведут из (5, 6- д >) -цитидиитрифосфата инкубированием его с клетками

Е.coli К12Е 125 ° находящимися на хранении в музее культур микроорганизмов Института молекулярной генетики АН СССР, обработанными эфиром.

Процесс ведут в буфере с рН 8,1;8,3 в присутствии ацетата магния и дитиотрейтола с порционным добавлением креатиндосфата, креатинфосфокиназы до образования ДФ. Для получения МФ продукт ДФ гидролизуют в кислой среде при нагревании, а для образования ТФ ведут дополнительное инкубирование с добавлением креатинфосфата и креатинфосфокинаэы. Способ обеспечивает получение новых дважды меченных тритием дозокснцитидиннуклеотидов с молекулярной радиоактнвностью до 58 Кй/ммоль и выходом

70 - 90 Ж (без выделения промежуточных продуктов). 4 табл.

1 1319503 2

Изобретение относится к новому разморажиная их непосредстненно перед способу получения ранее неописанных проведением реакции. меченных тритием дезокси-(5,6- Н )" Пример 2, Биосинтез дезоксицитидин- 5 -моно-, -ди- и трифосфа- (5, 6- Н ) -цитидиндифосфата. тов. Меченные тритием деэоксицити- 5 Реакционную смесь содержащую, днннуклеотиды широко используются мкмоль/мл:(5,6 — ф-цитидинтрифосфат

3 в биохимических исследованиях, иссле- 0,4 (52 Ки/ммоль); дитиотрейтол 8; дованиях по молекулярной биологии, М11(СН СОО) 10, Tris-HC1 буфер молекулярной генетике и эксперимен- (рН 8,1) 40 и обработанные эфиром тальной медицине. В последние годы 10 клетки 2,5 мг (по белку) иа 1 мл ревозросли требования к молярной радио- акционной смеси, инкубируют в водя/ активности этих препаратов. ной бане при 37 С н течение 20 мин, Целью изобретения является разра- Затем три раза порциями через каждые ботка нового способа получения новых 20 мин (т,е. через 20, 40 и 50 мин кратно меченых дезокси-(5,6-ЗН )-ци- 15 инкубирования) добавляют по 0,4 тидинмоно-, -ди- и -трифосфатов вы- мкмоль креатинфосфата и 0,1 мг креасокой молярной радиоактивности. гинфосфокинаэы. Через 80 мин инкубиСпособ осуществляют путем проверонания реакцию останавливают удаледения реакции знзиматнческого восста- нием клеток центрифугиронанием при новления рибозы, входящей в состав 20 10000 об/мин и осаждают оставшийся дважды меченного тритием (5,6- H ) — н супернатанте белок добавлением цитинтрифосфата, до 2 -дезоксирибо- 50 .-ной трихлор уксусной кислоты до зы с образованием дезокси-(5,6- Н ) — 5X-ной концентрации ее в объеме рецитидиннуклеотидон высокой молярной акционной смеси, Образовавшийся осарадиоактивности (до 58 Ки/ммоль) ° 25 док удаляют цевтрифугированием. ЦеИзобретение иллюстрируется следую- левой продукт выделяют из реакционщими примерами, ной смеси с помощью колоночной ионоПример 1. Обработка клеток обменной хроматографии на ДЕАЕ-целE.coli Kl2Е125 эфиром, люлозе н НСО форме в градиенте конКлетки Е. coli K12EI25 выращивают 30 центрации триэтиламмоний бикарбонапо известной методике при 30 С на та О, 05-0,3М (рН 8,2), Скорость полноценной питатегьной среде н ус- элюции 100 мл/ч, Выход дезоксиловиях интенсивной аэрации до стадии (5,6- Н ) -цитидиндифосфата по мечесредней логарифмической фазы, Биомас- ному (5,6- H )-CTP составляет 70Х, су осаждают центрифугиронанием и 35 Готовый препарат d = (5,6. — Н )-СДР

I трижды отмывают от среды физиологи- подвергают хроматографическому анализу ческим раствором. н тонком слое на PEI-cellulose /"Merck" (5 r клеток суспендируют в 35 мл ндвух системах: 1MNaC1 и 0,15 буфера, содержащего 0,5m .М сахароэы, NaC1 в насыщенном растворе Н ВО, .ПодСуспензию переносят в делительную 40 вижность (К ) полученного препарата воронку и добавляют к ней 35 мл све- равна подвижности стандартного образжеперегнанного эфира.. Смесь очень ос- ца d-СДР ("Кеапа1", Венгрия) . УФторожно перемешивают в течение 1 мин спектр препарата полностью соответи разделяют на две фазы, Эфирную фа- ствует характерному для него спектру, . эу отбрасывают. К отделенной суспен- 45 Радиохимическая чистота не менее зии клеток добавляют еще 18 мл буфе- 95 . Молярная радиоактивность бра, содержащего 0,5ш М сахарозы и (5,6- Н )-СДР ранна 52 Ки/ммоль, эту суспенэию осторожно наслаивают Пример 3. Биосинтез дезоксив 6 центрифужных пробирок, наполнен- (5,6- Н ) -цитидижюнофосфата, -3 иых 6-8 мл буфера, содержащего 0,8m 50 Состав реакционной смеси и усло.М сахарозы. Клетки отделяют центри- вия инкубиронания пс примеру 2, Чефугированием при 7000 об/мин в тече- рез 80 мин инкубирования реакцию ние 8 мин. Полученный осадок суспен- останавливают удалением клеток центдируют в 15 мл буфера, содержащего рифугированием при 10000 об/мин . К

0 5m М сахарозы, Содержание белка н 55 полученному супернатанту дсбанляют ю полученном таким образом клеточном 40 -ную НС10< до 1ОХ-ной концентра" препарате составляет 25-,30 мг/мл. Oб- ции ее н объеме реакционной смеси работаяные эфиром клетки хранят в за- для проведения химического гидролио мороженном виде при температуре -70 С, 3a d-СДР до d-СИР. Смесь ныдержива03

Ф о р и у л а изобретения

Способ получения меченных тритием дезокси-(5,6- Н )-цитидин-5 -моно- -ди- и трифосфатов о т л и—

t 1

Э ч а ю щ н и с я тем, что (5,6- Hq)цитидинтрифосфат инкубируют с клетка-, ми E..cali К! 2Е 125, находящимися на хранении в музее культур микроорганизмов Института молекулярной генетики АН СССР, обработанными эфиром, в буфере с рН 8,1-8,3 в присутствии ацетата магния и дитиотрейтола с порционным добавлением креатинфосфата и креатинфосфокиназы до образования дезокси (5,6- Н2)-цитидин-5 -ди3 I фосфата, который или гидролизуют в кислой среде при нагревании с образованием деэокси-(5,6- Нд)-цитидин-5 -моиофосфата, или дополнительно инкубируют с добавлением креатинфосфата и креатинфосфокинаэы с образованием дезокси-(5,6» Н )-цити«з дин-5 —.,трифосфата

3 13195 ют s водяной бане при t = IOO C в. течение 0 мин, . затем нейтрализуют ее добавлением 5М КОН. Образовавшийся осадок КС10, удаляют центрифугированием, Целевой продукт d- 5 (5,6- Н ) "CMP выделяют известным

"«з способом, например, с помощью коло" ночной ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, Выход деэокси" (5,6 -ЗН ) - цитидинмонофосфата по ме- 10 чеиому (5,6->H> )-СТР составляет 80Х.

Готовый препарат d-(5,6- H ) -СИР подвергают хроматографическому анализу в тонком слое на PEI-се11п1оэе ("Мегс1с") в двух системах: IM NaCl и 0,15M NaCl в насыщенном растворе

H>B0> . Подвижность (Rp) полученного препарата равна подвижности стандартного образца d-CMP ("Кеапа1", Венгрия). Радиохимическая чистота прела- 20 рата составляет ие менее 957.. УФспектр его полностью соответствует характерному для него спектру. Молярная радиоактивность.d (5,6- Yg)—

СМР равна 52 Ки/имоль, 25

Пример 4. Биосинтез деэокси(5,6- Н ) -цитидинтрифосфата

Состав реакционной смеси и условия инкубиронания по примеру 2. Через 80 мин инкубирования в реакционную смесь добавляют 10 мкмоль креатинфосфата, О,! мг креатинфосфокинаэы и и ее еще в течение

30 мин. Реакцию останавливают удалением клеток центрифугироваиием при 35

10000 об/мин и осаждением оставшегося в супернатанте белка добавлением . к нему 507-ной трихлоруксусной кислоты до 5Х-ной концентрации ее в объеме реакционной смеси. Образовав- 40 шийся осадок удаляют центрифугированием. Целевой продукт- d-(5,6- Н )СТР выделяют известным способом, например, с помощью ионообменной колоночной хроматографии на ДЕАЕ-,целлюлозе. Выход дезокси-(5,6- Н )-цитидинтрыфосфата по меченому (5,6- P )4 цитидинтрифосфату составляет 80Х, Готовый препарат d-(5,6- Н ) "СТР подвергают хроматографическаму анализу в уонком слое íà PEI-целлюлозе ("Marek") в двух системах: IМ NaCI и в 0,15M NaCl в насыщенном растворе

Hg ВО (препарат предварительно гидролиэуют до d-CMP). Радиохимическая чистота препарата составляет не менее 95Х, УФ-спектр его полностью со- . ответствует характерному для него спектру, Малярная радиоактивность .

d-(5,6- Н )-СТР равна 52 Ки/ммоль, Табл. 1-4 иллюстрируют выбор оптимальных условий проведения биосинтеза каждого из деэокси-(5,6- H<)-цитидиимоно-, -ди-, и -трифосфатов, Предлагаемый способ позволяет по" лучать дважды меченные тритием дезоксицитидиннуклеотиды с молярной радиоактивностью до 58 Ки/ммоль без выделения промежуточных продуктов с выходом 70-80%.

)319503 й

6 .Таблица l

Преверы биосиитева дезокси-(5,6- Н )-цнтидиинуклеотидов

Выход целевого продукта, X

79

30.

Температура, С

70

40

36., 0,3. 10 М 43

Концентрацияя

М8 2

0710 М 79

1,10 2М

80

4,)О М 45

41

41.

37

5,5

8,) 70

79

8,3

68

0 25 10 М 38

33

Днтнотрейтол- О, 8.-! О М 80

70

1,5-10 М 81

33

35

65

8I

70 4

Частота каждые добавления 10 мин порций Каждые

25

80

80

Условия проведения биосннтеза

Величина О, l порции креатинфос- 0,35 фата и по

0,1 мг 0,4 креатинфосфоки- 8 казы, мкмоль

«»«» »«

)-(5;6- Í ) -,)-(5,6- И,) - )-(5,6-Зя )° СИР СДР СТР

1319503

Продолжение табл; 1

Условия проведения биосинтеэа

Выход целевого продукта, Х

«» ««Ю«

d-(5,6- Н ) - 1-(5,6- Í,) - d-(5,6- Н,)

" CMP СДР СТР

««\ ««««««««««««» «««««

20 .мин креатинфосфат

Каждые

30 мин

30 35, Время инкубации

40 мин

80 мин !О

10

40 мин+ гидролиз

80 мин+гид- 80 ролиэ

40 мин + 2

30 мнн с креатинфосфатом

80 мнн +

30 мин 2 с креатинфо сфа том

10

Таблица2

Влияние концентрации буферов (Tris HCl или HEPES) на выход й-(5,6- Н )-СТР

Молярность буферов 0,001 Ор02 0,04 0,06

0,8

Выход

d-(5,6- Н )-СТР.

ЗХ 59Х

5Х 75X

80Х

«»»

Та блица 3

Влияние количества добавляемой креатинфосфокинавы на выход d-(5,6- H))-CTP

Количество креатин фосфокиназы,мг 0,0! 0,.05

О,!

Выход

d-(5,6- Н1)-СТР,X 32

79

70

l3l9503!

Таблица 4

Влияние количества взятого креатинфосфата и времени дополнительного инкубирования при биосиитезе d-CTP

Количество креатиифосфата,,мкмоль

20

Выход

Й-(5,6- !! ) --СТР,У 20 70

82

Время дополнительного инкубирования, мин

lO 20

30

Выход а-(5,6- Н,)-СТР,7. !8

79

Составитель В.Смоляков

Техред Л Сердюкова оРРектоР M,Пожо

Редактор Г,Бельская

Заказ 2488 Тираж 325 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий!

l3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4