Способ определения скорости метаболизма акрилатов в микросомальном препарате

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской ксенобиохимии, токсикологии, профпатологии и патологической физиологии. Цель изобретения - повышение точности, чувствительности и упрощение способа. Цель достигается путем инкубации 5-30 мкм метакрилатов в инкубационной среде, состоящей из 1,0 мл 0,05-0,200 М трис НС буфера (рН 7-8,0), 0,5 мкм НАДФН, 5 мг/нл микросомального белка. Инкубацию приводят не менее 5 мин при 37°С, затем реакцию останавливают ТХУ, отделяют супернатант, добавляют к нему 2 мл раствора реагента, содержащего 0,004 мл ацетилацетона, 0,006 мл ледяной уксусной кислоты и 0,3 г уксусно-кислого аммония, продукт реакции измеряют при 412 нм с последующим расчетом количества образовавшегося формальдегида . Способ обладает в 6 раз большей чувствительностью по сравнению с прототипом и значительно сокращает время проведения массовых анализов. 1 ил., 8 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st) s G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4638608/14 (22) 26.08.88 (46) 23.12.91. Бюл. М 47 (71) Красноярский государственный медицинский институт (72) Ю.В,Котловский, В.А.Мытников и

В.В.Иванов (53) 616.07(088.8) (56) Toxicol. Appl. Pharmacol., 1981, М 57, рр.208 — 219. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ

МЕТАБОЛИЗМААКРИЛАТОВ В МИКРОСОМ АЛ b H0M П Р Е ПАРАТЕ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской ксенобиохимии, токсикологии, профпатологии и патологической физиологии. Цель изобретения — повышение точности, Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской ксенобиохимии, в токсикологии, профпатологии и патологической физиологии.

Целью изобретения является повышение точности, чувствительности и упрощение способа, Цель реализуется путем.инкубации при

37 С 5 — 30 мкм MA в инкубационной смеси, состоящей из 1,0 мл 0,05-0,200 M трис-HCI буфера (рН 7 — 8,0), 0,5 мкм НАДФН, 5 мг/мл микросомального белка при времени инкубации, равном не менее 5 мин, и оценкой скорости метаболизма акрилата по уровню образования формальдегида (Ф).

На чертеже дан график (кривые 1 и 2), поясняющий предлагаемый способ.,, Ы,, 17ОО475 Al чувствительности и упрощение способа.

Цель достигается путем инкубации 5 — 30

MKM метакрилатов в инкубационной среде, состоящей из 1 0 мл 0,05 — 0,200 M трис HCI буфера (р Н 7-8,0), 0,5 мкм НАДФ Н, 5 мг/-я микросомального белка. Инкубацию пр водят не менее 5 мин при 37 С, затем реакцию останавливают ТХУ, отделяют супернатант, добавляют к нему 2 мл раствора реагента, содержащего 0,004 мл ацетилацетона. 0,006 мл ледяной уксусной кислоты и 0,3 r уксусно-кислого аммония, продукт реакции измеряют при 412 нм с последующим расчетом количества образовавшегося формальдегида. Способ обладает в 6 раз большей чувствительностью по сравнению с прототипом и значительно сокращает время проведения массовых анализов. 1 ил., 8 табл.

Способ осуществляется следующим образом.

По способу используют микросомы (MK), полученные из печени крыс.

У забитых животных методом срединной лапаротомии вскрывают брюшную стенку и перфузируют при 4 С печень раствором 50 мМ трис-HCI (рН 7,4), содержащим 1,15;4 KCI и 0,5 мМ ЗДТА. Печень измельчают ножницами, смешивают с раствором перфузата в соотношении 1 г ткани

: 3 мл перфузата. Гомогенат печени центрифугируют при 17000 g на протяжение 10 мин, после чего берут надосадочную жидкость, разводят 50 -ным раствором ПЭГдо конечной 5%-ной концентрации ПЭГ и центрифугируют 10 мин при 18 000 об/мин, 1700475

Л Е 1,25 1000

1,5 Б Т

ЛЕ = Et- Ео, Определение микросомального белка проводят методом Лоури. Общее содержание цитохрома P-.450 определяют по СО-пику в дифференциальном спектре восстановленного гемопротеида методом Omuro Т., Seto

R. Определение генерации Ф проводят при инкубации 5,30 и 180 мМ MA с 5-12 мг/мл белка микросом печени крыс в инкубационной смеси объемом 1,0 мл, состоящей из

0.05 — 0,200 M трис-HCI буфера (рН 7,0-8,0), 0,5 мМ НАДФН, Инкубацию проводят при

20, 37, 45 С на протяжении 5,,5, 45 мин.

Реакцию останавливают добавлением 20

ТХУ в количестве 0,25 мл на 1 мл инкубационной среды. Содержание Ф определяют в пробах до и после инкубации акрилатов с помощью цветной реакции с реактивом НАШЕ по известному методу, суть которого заключается в осаждении белка центрифугированием при 7 000 об/мин на протяжении 10 мин. К 0,5 мл полученного супернатанта добавляют 2,0 мл раствора

НАШЕ, после чего проводят инкубацию в водяной бане при 37 С на протяжение.45 мин. Измерение оптической плотности окраски по ОД проводят на СФ-26 при длине волны 412 нм. Подсчет Ф проводят, исходя из коэффициента малярной экстинкции, равного 1,5 см мМ . При этом из показаний ОД опытов вычитается ОД фона, равная экстинкции образца перед проведением их инкубации. Скорость метаболизма акрилата рассчитывается по формуле где Т вЂ” время инкубации, мин;

Б — белок, мг!мл в пробе; 1,5 — коэффициент молярной экстинкции Ф, равный 1,5 см MM (умножением на 1000, переводим скорость образования Ф из микромоль в наномоль);

1,25 — разведение 1 мл инкубационной среды добавкой 0,25 мл 20;4-ного раствора

ТХУ; где Š— оптическая плотность, полученная при инкубации за время 5, 15, 45 мин;

Š— оптическая плотность смеси при времени инкубации 0 мин.

Пример расчета скорости метаболизма метилакрилата в микросомальном препарате показан в табл.1.

В процессе микросомального метаболизма из MA метилметакрилата (MMA) обра5

55 зуется Ф (чертеж). Уровень его нарастает со временем инкубации, что видно иэ табл.2.

Скорость метаболизма MA зависит от концентрации НАДФН в инкубационной смеси.

Данные представлены в табл.3.

Результаты показывают, что 0,5 мМ

НАДФН является насыщающей концентрацией, Зависимость скорости окисления МА от молярности трис-HCI буфера в инкубационной среде показана в табл.4.

Изучение зависимости оценки метаболизма MA от рН инкубационной среды показывает, что интенсивность его генерации через 5, 15 и 45 мин в сериях опытов, имеющих рН 7-8,0, не отличается. При рН 8,5 уровень Ф через 5 мин был в 1 9-2,7 раз ниже, чем в сериях опытов с рН 7,5-8,0 (табл.5). Эти результаты показывают, что интенсивность образования Ф одна и та же при значениях рН 7 — 8,0.

Скорость метаболизма MA зависит от рН инкубационной среды (табл.5).

Изучение зависимости скорости метаболизма от температуры инкубационной среды показывает, что при температуре, равной 37 С, уровень Ф немного выше при

20 и 45 С, через 5 и 45 мин инкубации разница была 2-кратной с достоверностями (Р<0,001; Р<0,05) при инкубации на протяжении 15 мин ври 37 и 45 С по сравнению с аналогичной серией опытов при 20 С (табл,6).

Эти результаты показывают, что метаболизм MA при температуре 37 и 45 С не отличается. Со снижением температуры до

20 С имеется резкое уменьшение скорости при 15 мин инкубации. Изучение зависимости скорости образования Ф от содержания белка, концентрации акрилата и времени инкубации представлено в табл.7. При нали- чии в инкубационной среде микросомального белка, равного 5 мг/мл, и 5 MM концентрации МА содержание Ф через 15 мин инкубации выше, чем через 5 мин (Р<0,05), а через 45 мин выше, чем через 15 мин (Р<0,001). При этом же содержании белка, но концентрации акрилата, равной 30 мМ, отмечается та же закономерность: содержание Ф через 45 мин выше, чем через

15 и 5 мин инкубации (Р<0,01).

Предложенный способ обладает в 6,6 раз более высокой чувствительностью и в 6 раз более высокой точностью по сравнению с прототипом и в 5 раз уменьшает затраты времени на проведение анализов. Достижение положительного эффекта предложенного способа по сравнению с прототипом представлено в табл.8.

1700475

Л Е 1,25 1000

1,5 Б Т

Таблица 1

П р и м е ч а н и е, Инкубационная смесь состоит из 0,1 М трис-НО буфера (рН 7,5), 1мМ

НАДФН, 30 мМ МА и 12 мг/мл микросомального белка печени контрольных крыс, По предлагаемому способу использовалась смесь объемом 1,0 мл, 0,1 M трис-HCI буфера, рН 7,4, содержащая белка 5 или 12 мг; белка микросом печени 5 или 30 мкм, метилметакрилата, суспендированного в

0,83; -ном тритоне. Инкубация проводилась при 37 С на протяжение 45 мин при постоянном встряхивании. По известному способу использовалась смесь объемом 3,0 мл, состоящая из 0,26 мМ бикарбонатного буфера, рН 7,4; 33 мг белка микросом печени, 90 мкм метилакрилата, суспендированного в 0,83 -ном тритоне. Инкубация проводилась при 37 С на протяжении 20 мин при постоянном встряхивании. По предлагаемому способу измерялся формальдегид, а по известному — акриловая кислота.

Формула изобретения

Способ определения скорости метаболизма акрилатов в микросомальном препарате путем инкубации акрилатов в присутствии реагента, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, чувствительности и упрощения способа, инкубационная смесь дополнительно содержит

НАДФН в насыщающей концентрации, инкубацию проводят не менее 5 мин при 37ОС, затем реакцию останавливают ТХУ, отделяют супернатант, добавляют к нему 2 мл раствора реагента, содержащего 0,004 мл ацетилацетона, 0,006 мл ледяной уксусной

5 кислоты и 0,3 г уксусно-кислого аммония, измеряют продукт реакции при -"i2 нм, а количество образовавшегося формальдегида (наномоль/миллиграмм белка за время инкубации, минута) рассчитывают по фор10 муле

15 где Т вЂ” время инкубации, мин;

Б — белок, мг/мл в пробе;

1,5 — коэффициент молярной экстинкции формальдегида, равный 1,5 см мМ

1,25 — разведение 1 мл инкубационной

20 среды за счет добавки 0,25 мл 20 -ного раствора ТХУ;

ЛЕ = Et- Eo где Š— оптическая плотность, измерен <ая после инкубации в течение 5, 15, 45 мин;

25 Ео — оптическая плотность при времени инкубации 0 мин.

Таблица 2

Таблица 3

П р и м е ч а н и е. Инкубационная смесь состоит из 0,1 М трис-НО буфера. рН 7,5; 0,5 мМ ЭДТА, 5 мг микросомального белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси.

Каждый опыт проведен на пуле микросом, объединенных от трех животных.

Таблица 4

П р и м е ч а н и е. Инкубационная смесь трис-HCI буфера содержит(рН 7,5) 5 MM MgCI2;

0,5мМ, ЭДТА, 1 мМ НАФДН, 5 мг микросомального белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси. Опыты проведены на пуле микросом, объединенных от трех животных.

Таблица 5

1700475

Таблица 6

Таблица 7

Таблица 8

П р и м е ч а н и е. Инкубационная смесь состоит из 0,1 M трис-HCI (рН 7,5),0,5 мМ

НАДФН, 5 — 180 мМ МА, 5 — 12,0 мг микросомального белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси.

Составитель Т. Малютина

Редактор Л. Гратилло Техред M,Моргентал Корректор М. глаксимишинец

Заказ 4464 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101